马铃薯脱毒试管苗繁殖及温室移栽技术研究

常 瑛，李彦荣

（甘肃省农垦农业研究院，甘肃 武威 733006）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）为茄科茄属植物，是我国重要的粮、经、饲兼用作物，在我国分布广泛，栽培面积占世界第2位。甘肃省马铃薯常年播种面积达60万hm2以上，约占全国播种面积的10%，列西北五省第1位，是我国马铃薯主要生产及加工基地之一[1]。近年来，随着马铃薯产业的发展，播种面积逐年扩大，产生了较好的经济和社会效益。但由于马铃薯是无性繁殖作物，经过多年留种种植后，体内病毒如马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯M病毒（PVM）和类病毒（PSTV）等逐代传递并积累，使马铃薯植株矮化，茎秆细弱，叶片失绿、卷曲或皱缩，薯块变小或畸形而减产30%～50%，对生产造成严重的危害。自1955年法国Monel首次采用马铃薯茎尖剥离生产无病毒植株生产脱毒薯苗应用以来，世界各地纷纷采用马铃薯茎尖脱毒快繁技术。我国也于上世纪70年代初进行了马铃薯茎尖组织培养，有效地防止了病毒感染和品种退化，提高了良种繁育的速度和产量。马铃薯无病毒苗的繁育及温室移栽主要技术在生产上推广应用，有着重要的现实意义。

1 脱毒苗的培养

1.1 马铃薯茎尖材料的处理

1.1.1 茎尖接种材料的选取 脱毒处理所用茎尖取自生长活跃的芽，顶芽的茎尖成活率最高。马铃薯茎尖培养脱毒的效果与茎尖大小直接相关，茎尖附近的病毒浓度呈递减分布，茎尖越小脱毒效果越理想。由于茎尖越小成活率越低，茎尖大小及芽的选择就尤为重要，一般取带1～2个叶原基的茎尖约0.1～0.5 mm[2-4]。叶原基提供茎尖生长和发育的内源生长素和细胞分裂素。尤其应注重茎尖大小，一般按0.2～0.5 mm长度切取，易脱毒、也易成活，既保证了一定的成活率，又能排除大多数病毒。

1.1.2 茎尖接种材料的消毒 茎尖接种材料的常见消毒方法有3种（表1）。一般情况下，剪取含叶原基的马铃薯茎尖芽条1～1.5 cm，采用常规消毒法既能达到消毒的目的。如果茎尖材料脱毒前能够结合化学、物理热处理、光照等效果更佳。

表1 径尖接种材料的消毒方法

1.1.3 茎尖的接种 将经消毒处理的茎尖材料置于体视镜的承物台上，在40倍的目镜下左手拿镊子夹住茎尖材料，右手用解剖针由外向里逐层将茎尖生长点的小叶片和叶原基剥离掉，最后只保留带1～2个叶原基的生长点，大小约为0.2～0.3 mm。

茎尖剥离后，用解剖针“切”下生长点接种于经高压灭菌的培养基上，封严瓶口放于培养室内培养。

1.2 茎尖培养

1.2.1 培养基 马铃薯茎尖培养以MS培养基为基础，并添加其它植物激素，以提高成苗率，缩短试管苗生长周期。实践证明，6-苄基腺嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）和萘乙酸（NAA）是马铃薯试管苗快繁中使用较多的植物激素。6-BA是诱导茎尖产生丛生芽的主要物质；GA3能显著促进试管苗株长高，特别是生长矮小的试管苗对培养基中GA3浓度有明显反应；NAA除能增加试管苗高度外，还能延长试管苗各节节间长度和增加切段繁殖的可用节数。

罗玉等[2]在MS的基础上，添加0.1 mg/L GA3、0.1 mg/L NAA和0.05 mg/L 6-BA时，成苗较多，都有愈伤组织化的情况；林丛发等[3]则在MS的基础上，添加0.05 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、0.1 mg/L GA3和3%蔗糖，pH值5.8；而崔根芳等[5]研究认为采用2倍MS液体培养基，添加0.1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、0.3 mg/L生长延缓剂B9、0.3%的活性炭和2.5%蔗糖，不仅能缩短试管苗生长周期，加快繁殖速度，提高移栽成活率，而且还可降低成本，比常规固体培养省时2/3，相对节电50%，省工40%，降低培养基成本30%，植株在液培中能充分得到热、气、水、养的协调供应，生长快而健壮。

1.2.2 培养条件 茎尖培养条件是：温度23～25℃；光照强度2 000～4 000 lx；光照时间为12～16 h/d左右。若高于26℃易产生顶部烧苗现象，33℃以上，则瓶苗停止生长[3]。在正常条件下，经过30～40 d的培养，可见到茎尖有明显的增长。大约3～4个月后就能长成小植株。

1.3 病毒检测

病毒检测的目的，是鉴定所获得的试管苗是否完全脱除所有病毒。病毒检测方法有两种：一种是生物学方法，一种是血清学方法。目前血清学方法应用普遍的是“酶联免疫法（ELISA）[6]”。

1.4 脱毒试管苗继代扩繁

经病毒检测获得不带任何病毒的试管苗后，首先在三角瓶或罐头瓶内进行扩繁。试管苗快速扩繁是脱毒马铃薯种薯繁殖的第一步。通过继代扩繁使试管苗达到一定的基数是提高脱毒种薯生产量的关键，只有繁殖出足够的试管苗，才能保证繁殖出足够的脱毒微型薯。脱毒苗继代扩繁是在无菌条件下切取带1～2个叶片和腋芽的节段接种于继代培养基上，待其长满瓶后再切段接种繁殖。

1.4.1 继代扩繁培养基 试管苗快速繁殖，既可采用固体培养基，也可采用液体培养基。培养基的成分是MS培养基，pH值5.6，不加有机物和植物激素。固体培养基中加入0.8%琼脂（也可用魔芋粉），液体培养基则不加琼脂。

1.4.2 茎节切段繁殖方法 茎节切段繁殖，是在无菌条件下将保存的基础试管苗，按茎节切段接种于扩繁培养基上进行培养。每个三角瓶内培养5～7个独立节段（罐头瓶可培养15～20个），置于组培室普遍采用的多列多层组培架上立体培养，培养温度23～25℃，光照强度3 000 lx，光照时间16 h/d。培养20 d左右，脱毒苗达到5～7 cm、茎粗0.6～0.8 mm、叶片5～8片时就可移栽。

1.4.3 壮苗培育 为了提高马铃薯脱毒试管苗的移栽成活率，通过继代扩繁不仅要培育繁殖出足够数量的试管苗，而且更应培育壮苗。其措施一是充分利用太阳散射光[8]；二是在培养基中提高钾离子的浓度；三是添加合适浓度的生长延缓剂B9。王巧玲等[7]研究认为,当加入140～155 mg/L KH2PO4、10～20 mg/L B9时，培育的试管苗高度合适、粗壮、叶片大、好移栽，成活率达100%；赵克蓉[8]在MS培养基中添加30 mg/L B9和500 mg/L的矮壮素（CCC）来控制试管苗徒长，达到增加茎粗，缩短节间长度，增强试管苗长势的目的。

2 马铃薯脱毒苗的温室移栽

2.1 脱毒苗炼苗

脱毒马铃薯试管苗是在无菌、有营养供给、适宜光照、温度和100%的相对湿度环境中生长的，并有适宜的生长激素调节其生长代谢。一旦试管苗从试管内移到试管外，环境条件发生了变化，由异养变为自养，由无菌变为有菌，由恒温、高湿、弱光向自然变温、低湿、强光过渡，叶片的光合能力、气孔的适应能力和根的主动吸收能力需要逐渐发展，叶片表面的角质层需要逐渐形成。因此，通过光培炼苗，尽可能使试管苗适应外界生存的环境，以提高移栽成活率。脱毒马铃薯试管苗移栽前，首先打开瓶口，逐渐降低湿度，增强自然光光照，通过驯化，新叶逐渐形成蜡质，产生表皮毛，降低气孔开度，逐渐恢复气孔功能，减少水分散失，促进新根发生，以适应环境。一般情况下初始光线应为日光的1/10，其后每3 d增加10%，逐渐达到7 000～10 000 lx，中午适当遮荫；湿度按开始3 d为饱和湿度，其后每2～3 d降低5%～10%，直到与大气相同。经过7～10 d左右的炼苗后，脱毒马铃薯试管苗就可进行移栽了。

2.2 苗床的准备

2.2.1 苗床的配制 移栽脱毒苗的苗床介质关键是疏松通气，适宜的保水性，而且不易滋生杂菌。一般选用粗粒状蛭石、粗沙、炉灰渣、锯木屑等，或将它们以一定的比例混合使用。或在塑料大棚等温室内南北向用干净的河沙或蛭石配制苗床，最好采用蛭石，或蛭石和珍珠岩按1∶1的配比，并用水和好（手握成团但不淌水），铺在温室床内，厚度3～5 cm，刮平后消毒待栽。

2.2.2 苗床的消毒 消毒时用代森锰锌750～800倍液，或敌克松800～900倍液，或多菌灵1 000倍液，或百菌清600～800倍液，或1%福尔马林溶液任选一种。苗床消毒5 d后即可进行移栽。

2.3 脱毒苗移栽及管理

经过5～7 d的光培炼苗后，试管苗就可由瓶内移栽到苗床上。移栽前浸湿或浇湿苗床基质，移栽时一定要避开中午的强光，或采取遮阳网遮荫措施，降低光强。

移栽时采用开浅沟栽苗，按行距4～5 cm，株距3 cm左右开深1～2 cm的浅沟，把用15℃（35～40℃）的清水洗净根部液体（固体）培养基的幼苗栽入，大苗宜深，小苗宜浅，栽后轻轻挤压苗基部，并用喷（洒）壶适时适量喷（洒）水，使苗根部与基质接触，但不可出现积水现象。然后在其上部用塑料薄膜搭一高20～30 cm的小拱棚。

试管苗移栽后，根据温室内温度和光照强度适当遮荫，控制光温条件。温度：马铃薯喜冷凉，不耐高温，块茎形成和膨大的最适宜温度为16～18℃，昼夜温差大对块茎形成和膨大有利，温度过高，蒸腾作用加强，并易滋生细菌类，同时，温度不宜过低，否则幼苗生长迟缓或不易成活。湿度：拱棚内前5 d保证苗床90%以上的湿度，7 d后在小拱棚上逐渐增加开孔数，降低湿度，15 d后去掉小拱棚。光强：自然光周期下3 000～10 000 lx。脱毒苗成活后，根据苗情每隔1～2 d喷浇1次小水，苗弱时可喷施0.5%～1.0%的尿素或0.2%的磷酸二氢钾等营养液，10～15 d一次，苗徒长时喷施多效唑或矮壮素。

[1] 李继明，李守强，田世龙，等.甘肃马铃薯贮藏保鲜中存在的问题及建议[J].甘肃农业科技，2009，（11）：21-23.

[2] 罗 玉，冉春玲，张 铁，等.滇东南农家马铃薯品种脱毒植株的获得[J].中国马铃薯，2000，14（4）：210-211.

[3] 林丛发，魏泽平，罗仰奋，等.马铃薯试管苗培育快繁八要点[J].福建农业科技，2001，（1）：37.

[4] 曹孜义，刘国民.实用植物组织培养技术教程[M].甘肃：科学技术出版社，1996.

[5] 崔根芳，郭忠贤，杨 春.马铃薯试管苗高效快繁技术研究[J].内蒙古农业科技，1998，（增刊）：64-66.

[6] 谢 思，易图永，肖启明.马铃薯Y病毒的株系分化及检测方法研究进展[J].中国农学通报，2011，27（5）：40-43.

[7] 王巧玲，李淑芳，王丽爱，等.马铃薯试管苗壮苗培育初探[J].马铃薯杂志，1999，13（3）：155-156.

[8] 赵克蓉.植物生长调节剂控制马铃薯试管苗徒长的作用[J].中国马铃薯，2000，14（3）：150-152.