苯丙氨酸缺乏幼建鲤的病理组织学观察及抗氧化能力变化

曾 婷冯 琳，2，3刘 扬，2，3姜 俊，2，3周小秋，2，3*

(1.四川农业大学动物营养研究所，雅安 625014;2.动物抗病营养四川省重点实验室，雅安 625014;3.鱼类营养与安全生产四川省高校重点实验室，雅安 625014)

苯丙氨酸(Phe)是鱼类的必需氨基酸［1］。目前，有关苯丙氨酸缺乏对鱼类影响的研究主要集中在生长性能方面。研究表明，苯丙氨酸缺乏导致印度鲤鱼(Cirrhinus mrigala)［2］和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)［3］等鱼类生长速度降低，饲料利用率和体蛋白质沉积下降。另有研究发现，苯丙氨酸缺乏使异育银鲫(Carassius auratus gibelio)的肝胰脏重量降低，肝脏中的脂肪含量升高［4］。而关于鱼类缺乏苯丙氨酸的表观症状和病理组织学变化的研究尚未见报道。动物体内的许多物质代谢后会产生羟自由基(·OH)，羟自由基可与蛋白质、核酸等多种大分子物质发生反应，从而影响细胞功能［5］。在犬上的研究发现，苯丙氨酸的苯环可与羟自由基结合形成邻位－酪氨酸(o-Tyr)、间位－酪氨酸(m-Tyr)和对位－酪氨酸(p-Tyr)3种羟化产物，从而能够在一定程度上清除羟自由基［6］。因此，苯丙氨酸可能与动物的抗氧化能力有关。本文通过饲喂幼建鲤苯丙氨酸缺乏饲料，旨在研究苯丙氨酸缺乏对幼建鲤组织器官病理变化以及抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲料

选择平均体重为(7.53±0.01)g的健康幼建鲤［购于通威原(良)种渔场］400尾，随机分为2组(缺乏组和对照组)，每组4个重复，每个重复50尾鱼，组间初始体重差异不显著(P＞0.05)。试验饲料是以鱼粉(智利进口的白鱼粉)、明胶和晶体氨基酸为主要蛋白质源的半纯合饲料。除苯丙氨酸外的必需氨基酸组成模拟34%全卵蛋白质模式［7］，不足的必需氨基酸以晶体氨基酸形式添加。缺乏组饲料中苯丙氨酸含量实测值为1.9 g/kg，对照组饲料中苯丙氨酸含量根据预试验确定的幼建鲤苯丙氨酸需要量设计，实测值为10.9 g/kg。试验饲 料 中 锌［8］、铁［9］、维 生 素 B6［10］、泛 酸［11］、肌

醇［12］、硫胺素［13］和核黄素［14］含量根据本实验室研究得出的幼建鲤对相应物质的需要量确定，钾、钠、碘、硒、维生素D和维生素B12含量参照虹鳟的需要量确定，维生素K含量参照湖鳟的需要量确定，其他营养素的含量参照NRC(1993)鲤鱼营养需要量确定。试验饲料组成及营养水平见表1。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) g/kg

1.2 饲养管理

将购回的鱼苗用氯化钠(0.8%)、碳酸氢钠(0.4%)消毒并分组，以重复为单位饲喂于配有自动循环水过滤系统和自动增氧系统的水族箱(90 cm×30 cm×40 cm)中，经4周驯化后开始正式试验，试验期为60 d。试验期间，经生物过滤池过滤后的循环水以1.2 L/min的速度流入水族箱，水温为(25±2)℃，pH 为 7.0±0.3，溶解氧≥5 mg/L。试验开始后每15 d用氯化钠(0.8%)对水体消毒1次。驯化期饲料与试验期对照组饲料一致，驯化期管理模式和水质条件与试验期一致。驯化期每天投喂6次，试验期前期(1～30 d)每天投喂6次，后期(31～60 d)每天投喂4次。

1.3 表观症状及病理组织学观察

在试验期间，通过肉眼观察缺乏组幼建鲤的表观症状，并记录出现症状的时间、尾数以及症状情况。试验结束后，每个重复随机选5尾鱼，分别取肠道(分为前肠、中肠和后肠3段)、肝胰脏、脾脏、鳃丝和肌肉，用100 mL/L的中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片，苏木精－伊红(HE)常规染色，倒置显微镜观察病理组织学变化。

1.4 血清抗氧化指标检测

试验结束后，每个重复随机选6尾鱼，饥饿12 h后尾静脉采血。血液4℃静置过夜后，于3 000×g、4℃离心10 min取血清，－70℃保存，用于抗氧化指标的测定。血清丙二醛(MDA)和蛋白质羰基含量的测定分别参照Livingstone等［15］和 Armenteros等［16］的方法;抗超氧阴离子能力(A-SAC)和抗羟自由基能力(A-HRC)的测定参照Jiang等［17］的方法;超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定参照 Zhang等［18］的方法;过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性的测定分别参照 Aebi［19］、Lora 等［20］和 Lushchak等［21］的方法;谷胱甘肽(GSH)含量的测定参照 Vardi等［22］的方法。

1.5 数据处理与分析

试验数据以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件对数据进行 t检验，P ＜0.05 为差异显著。

2 结果

2.1 苯丙氨酸缺乏幼建鲤的表观症状

苯丙氨酸缺乏组鱼的眼观表现为尾鳍向上弯曲(图1)，开始出现缺乏症状的时间为试验开始后的第5周。60 d的生长试验结束时，出现缺乏症的鱼有56尾，占缺乏组鱼总尾数的28%。

图1 苯丙氨酸缺乏(60 d)幼建鲤的表观症状Fig.1 Clinical symptom of juvenile Jian carp with phenylalanine deficiency for 60 days

2.2 苯丙氨酸缺乏幼建鲤的病理组织学观察

苯丙氨酸缺乏幼建鲤的病理组织学观察如图2所示。前肠、中肠和后肠:缺乏组鱼的前肠、中肠和后肠皱襞顶端黏膜上皮出现凝固性坏死，且部分脱落进入肠腔;部分前肠和中肠肠黏膜的固有层轻微水肿，与黏膜上皮之间结构疏松，严重者肠黏膜中的毛细血管充血。肝胰脏:缺乏组鱼的肝细胞出现大量空泡变性，胞核偏于细胞一侧;部分肝细胞肿胀，体积增大;部分胰腺细胞肿胀、体积增大，细胞界限不清，胰腺腺泡中酶原颗粒减少。脾脏:缺乏组鱼的脾脏出现含铁血红素沉积。肌肉:缺乏组鱼的部分肌纤维肌浆凝固，形成无结构的红染团块，大量肌纤维出现不同程度的肌浆溶解，严重者肌纤维断裂。后肾:缺乏组鱼的后肾肾小球充血，体积肿大，部分肾小管上皮细胞肿胀，管腔轻度变形。鳃丝:缺乏组鱼的鳃小片毛细血管扩张充血，严重者鳃小片溶解、脱落，软骨消失。而对照组鱼的肠道(前肠、中肠和后肠)、肝胰脏、脾脏、肌肉、后肾和鳃丝的组织结构未见异常。

图2 苯丙氨酸缺乏(60 d)幼建鲤的病理组织学观察Fig.2 Histopathological observation of juvenile Jian carp with phenylalanine deficiency for 60 days(400 × )

2.3 苯丙氨酸缺乏幼建鲤的抗氧化能力变化

由表2可知，与对照组相比，缺乏组幼建鲤的血清MDA和蛋白质羰基含量显著降低(P＜0.05);血清 A-SAC、A-HRC，SOD、CAT、GSH-Px、GST、GR活性以及GSH含量显著升高(P＜0.05)。

表2 苯丙氨酸缺乏对幼建鲤血清抗氧化指标的影响Table 2 Effects of phenylalanine deficiency on serum antioxidant indices of juvenile Jian carp

3 讨论

3.1 苯丙氨酸缺乏幼建鲤的表观症状

关于苯丙氨酸缺乏引起鱼类骨骼畸形的研究尚未见报道。本试验结果显示，当饲料中苯丙氨酸缺乏时，部分幼建鲤出现尾鳍向上弯曲的表观症状。这可能与苯丙氨酸影响了参与骨骼骨化物质的合成有关，有待进一步研究。

3.2 苯丙氨酸缺乏幼建鲤的病理组织学观察

肠道是营养物质消化和吸收的主要场所，肠黏膜屏障系统具有阻碍肠腔内细菌入侵和毒素吸收的功能［23］，因此，肠黏膜结构的完整性对于动物机体十分重要。本研究发现，苯丙氨酸缺乏导致幼建鲤的前肠、中肠和后肠肠黏膜上皮细胞坏死、脱落，并且有些肠段出现黏膜毛细血管充血和固有层水肿的现象，表明苯丙氨酸缺乏会影响鱼类肠道结构完整性。肠道结构完整性与肠道消化酶和刷状缘酶活性密切相关［24］。姜维丹等［25］研究发现，肌醇缺乏引起幼建鲤肠黏膜结构完整性受损的同时，消化吸收功能也有所下降。因此，苯丙氨酸缺乏可能通过影响肠道结构完整性来进一步影响肠道的消化吸收功能。在本试验中，苯丙氨酸缺乏组幼建鲤的胰腺细胞、肝细胞、脾脏、后肾、鳃小片和肌纤维也发生不同程度的病理变化。在异育银鲫上的研究发现，苯丙氨酸缺乏导致肝胰脏重量下降，肝脏脂肪含量显著增加［5］。上述结果表明，苯丙氨酸缺乏可能通过影响鱼类胰腺和肝脏的组织结构来影响其生长发育和正常功能的发挥，导致消化酶的分泌和营养物质的代谢受到影响。关于苯丙氨酸缺乏对鱼类组织器官结构影响的研究尚未见报道。在鼠上的研究显示，肠道结构和功能与其抗氧化状态有关［22］。因此，本试验中苯丙氨酸缺乏导致的幼建鲤组织器官出现病理变化可能与其抗氧化能力降低有关。

3.3 苯丙氨酸缺乏幼建鲤的抗氧化能力变化

MDA是脂质过氧化的主要终产物［26］，MDA含量可以反映机体脂质过氧化损伤的程度;蛋白质羰基是蛋白质氧化的重要标记［27］，蛋白羰基含量可以反映机体蛋白质氧化损伤的程度。本研究发现，当苯丙氨酸缺乏时，幼建鲤的血清MDA和蛋白质羰基含量显著提高，表明苯丙氨酸缺乏导致鱼体的氧化损伤增加。超氧阴离子和羟自由基是2种常见的氧自由基，当其含量超出正常水平时，就会引发机体本身的脂质过氧化以及糖基和蛋白质氧化等氧化应激［6］。本研究发现，与对照组相比，苯丙氨酸缺乏组幼建鲤的血清A-SAC和A-HRC均显著降低，说明机体对超氧阴离子和羟自由基的清除能力降低。当机体产生自由基时，机体内的抗氧化酶和低分子抗氧化物质则开始参与还原自由基的过程，从而达到解毒的目的［28］。本研究发现，苯丙氨酸缺乏组幼建鲤的血清抗氧化酶活性以及GSH含量均显著降低，说明苯丙氨酸缺乏时机体中和自由基的能力即解毒能力减弱。苯丙氨酸缺乏引起机体抗氧化能力降低可能是导致内脏器官和肌肉组织病变的原因之一。

4 结论

①苯丙氨酸缺乏可引起幼建鲤尾鳍向上弯曲，组织器官出现不同程度的病理损伤。

②苯丙氨酸缺乏可导致幼建鲤抗氧化能力降低，氧化损伤增加。

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