志贺菌感染的多重PCR快速诊断技术的建立

王国富 吴利先 薛士鹏

志贺菌(shigellosis)又称痢疾杆菌，能侵袭结肠粘膜上皮细胞，引起人类细菌性痢疾。传统的检测方法必须经过分离培养和生理生化鉴定，甚至于全自动细菌鉴定仪等，检测周期长、步骤繁琐、许多因素难以控制，甚至存在误诊和漏诊，已经显现出很大的局限性。因此急需建立快速、敏感、特异的检测方法诊断菌痢，以采取有效防治措施。

随着微生物基因组学的发展，对志贺菌的基因结构已经清楚，分子生物学检测技术应用于志贺菌快速诊断已经成为可能，本研究在传统检测方法的基础上引入了多重PCR技术，将为临床快速诊断志贺菌提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 68株志贺菌来源于2010～2011年大理地区腹泻患者的粪便标本，大肠埃希菌和伤寒沙门菌由本室保存，PCR扩增仪为PE公司产品，PCR试剂盒购自北京晨绿生物公司。PCR所用引物:参照文献针对4个毒力基因设计4对引物，由北京晨绿生物公司合成如下:

表1 志贺菌多重PCR诊断所用需的4个毒力基因的4对引物

1.2方法

1.2.1用鉴定过的志贺菌进行多重PCR 将鉴定过的志贺菌培养过夜，分别取100 μl培养过夜菌，离心弃上清后加50 μl去离子水，沸水煮10 min后离心，取菌裂解液的上清2 μl为PCR模板，浓度为25 μmol/L的P1～P8各1 μl为引物进行PCR。反应条件为:95℃4 min后，按下列参数循环35次，94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，最后72℃延伸8 min。同时设大肠埃希菌为阴性对照。凡除了423bp处(ipaH)出现条带外，其他309bp(shetlA)、147bp(shetlB)及320bp(ial)任意一处出现条带均为阳性。凝胶成像仪拍照记录结果。

1.2.2直接用阳性粪便标本进行的多重PCR 为了确定多重PCR在志贺菌快速诊断中应用，本研究选取5份志贺菌阳性的粘液脓血便标本，直接用多重PCR进行扩增。具体方法是:取粪便标本0.2 g，用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取DNA，然后取2 μl作为模板，按上述参数进行扩增。

2 结果

2.1用鉴定过的志贺菌进行多重PCR结果 通过多重PCR扩增后，大肠埃希菌和伤寒沙门菌未出现条带，68株志贺菌均在423bp处出现了条带，其余的在147bp处、309bp处以及320bp处均出现了至少一个条带，与常规鉴定法的符合率达100%，结果见图1。

图1 多重PCR检测分离鉴定后的志贺菌毒力基因

2.2直接用阳性粪便标本进行多重PCR结果5份直接用粪便标本提取的DNA为模板进行多重PCR扩增后，也得到了同样的结果，见图2。

图2 多重PCR直接检测粪便中的志贺菌毒力基因

3 讨论

志贺菌所致的细菌性痢疾已经成为婴幼儿腹泻的第三大病因。传统的分离培养技术存在很大局限性。多聚酶链反应(PCR)具有快速、特异性和敏感性，已被国外学者用于追踪和检测细菌性腹泻［3，4］，特别是对菌量较少标本或经药物治疗标本中活菌量不多的标本，还有血清学标记不能鉴定的腹泻菌种。多重PCR是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同，但更能全方位高效率地检测志贺菌［1］。

Buysse等发现志贺菌侵袭性质粒抗原H(invasive plasmid，ipaH)存在于各型志贺菌，同时多拷贝存在于染色体和上，不随传代而丢失。但据 Phantouamath等［2］研究结果表明，单用ipaH基因PCR结果阳性并不一定发病，多是痢疾杆菌携带者。侵袭相关基因ial存在于侵袭性大质粒上一个2.5kb侵袭相关区段中，是志贺菌的又一毒力基因。后来Fasano等又报道两种志贺菌肠毒素编码基因shet1A和shet1B。菌痢患者除了ipaH基因阳性外，ial或shet1A或shet1B基因检测同时阳性，才能证明是痢疾杆菌感染，且具有致病性。因此本研究根据志贺氏菌的这4个特异性基因片段中的开放框架部分序列设计引物，进行多重PCR检测。

本研究选择了本室通过常规分离培养鉴定得到的68株志贺菌进行多重PCR扩增。结果68例志贺菌ipaH基因均为阳性;ial基因阳性率达95.6%(65/68)，shet1B基因为阳性率达89.7%(61/68)，shet1A基因阳性率为55.9%(38/68)。而伤寒沙门菌和大肠埃希菌的结果阴性，表明PCR法有很高的特异性。直接用粪便标本通过层析柱提取DNA后扩增结果同样为阳性。虽然粪标本中存在着己知和未知的抑制或干扰PCR检测的成分，但本试验模板DNA的提取使用的是QIAamp层析法，直接从粪中提取DNA。QIAamp是一种硅胶，能选择性结合DNA而分离糖类和蛋白质。将经过离心、溶菌酶和蛋白酶K处理的粪标本，用乙醇沉淀后，过QIAamp柱，再经Centrisep柱处理，可消除PCR抑制物，使检测的灵敏度达特异性都大大提高［5］。因此多重PCR技术检测志贺菌，具有快速、敏感和特异等优点，尽管不能区分菌种，但在临床诊断、治疗监测及流行病学调查方面显示出良好的实用性。

［1］Kotloff K L，Winickoff J P，Ivanoff B，et al.Global burden of Shigella infections:implications for vaccine development and implementation of control strategies.Bull World Health Organ，1999，77:651-6661.

［2］Phantouamath B，Sithivong N，Insisiengmay S，et al.Pathogerticity of Shigella in healthy carriers:a study in Vientiane，Lao People?s Democratic Republic .Jpn J Infect Dis，2005，58(4):232-234.

［3］Thong KL，Hoe1 SLL，Puthucheary SD，et al.Detection of virulence genes in Malaysian Shigella species by multiplex PCR assay.BMC Infect Dis，2005，5:8.

［4］陈晶，杨春莉，裘宇蓉，等.武汉社区腹泻病人粪便中致病菌的构成与耐药性研究.热带医学杂志，2007，7(4):326-329.

［5］李小丽，阴赦宏，温艳，等.PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因.世界华人消化杂志，2007，15(19):212-213.