甘露聚糖结合凝集素基因A/B位点与新疆维吾尔族结核病的相关性研究

2012-05-30 02:19周江张万江
中国防痨杂志 2012年7期
关键词:维吾尔族多态性基因型

周江 张万江

甘露聚糖结合凝集素基因A/B位点与新疆维吾尔族结核病的相关性研究

周江 张万江

目的探讨甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)基因的多态性是否与新疆维吾尔族人群结核病发病相关>。方法通过使用引物序列特异性PCR(SSP-PCR)的方法分别对226例新疆维吾尔族活动性肺结核患者(简称病例组)及231例有结核分枝杆菌接触史的新疆同民族健康者(简称对照组)进行MBL基因的A/B多态性位点进行基因分型,统计学分析采用病例对照分析研究不同基因型与新疆维吾尔族结核病易感性的关系>。结果在病例组中,MBL基因A/B位点 AA基因型106例(占46.90%),AB基因型106例(占46.90%),BB基因型14例(占6.20%);对照组AA基因型则为146例(占63.20%),AB基因型80例(占34.63%),BB基因型5例(占2.17%)。病例组中MBL-AB突变基因频率显著高于健康对照组,两组的突变基因频率分别为6.20%、2.17%,差异有统计学意义(χ2=5.224,Pc<0.05)>。结论新疆维吾尔族人群中 MBL基因AA基因型可能为结核病的保护性因素,BB基因型可能为结核病发病的危险性因素。新疆维吾尔族人群中MBL基因A/B位点多态性与结核病易感性有明显相关性。

结核,肺; 分枝杆菌,结核; 甘露糖结合外源凝集素; 聚合酶链反应; 疾病遗传易感性; 新疆[维吾尔自治区]

甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)基因表达蛋白属于一个庞大的蛋白质超家族——C型钙离子依赖性凝集素家族,由肝细胞分泌通过MBL的结构域糖元识别区与甘露糖、岩藻糖等糖类物质结合发挥生物学效应,故命名为甘露糖结合蛋白基因。正常人血清中MBL基因表达蛋白浓度在40~3500μg/ml之间,在疾病条件下,如细菌感染时血清MBL基因表达蛋白水平明显升高。有研究显示,当血浆MBL基因表达蛋白含量低于0.1mg/L时,MBL基因外显子54位既A/B基因全部为纯合子基因突变BB型;当血浆MBL基因表达蛋白含量高于1mg/L,大部分为未突变野生型AA;当血浆 MBL基因表达蛋白介于0.1~1mg/L之间,大部分为基因突变杂合子AB型,表明MBL基因外显子54密码子可能会明显影响到血浆中 MBL基因的含量[1]。

结核病疫情在我国呈“五多一高”的趋势和特点。(1)感染Mtb人数多:目前,我国已有5.5亿人受Mtb感染,其中10%的人将发生结核病,若流行与感染不能得到有效控制,今后10年感染人数将增加到8亿[2]。(2)现患肺结核病患者多:全国现有肺结核患者年发病数约130万例,占全球结核病总患者数的14.3%,在最近10年的传染病统计数据中,结核病的患病人数一直与乙型肝炎(简称乙肝)在争夺冠亚军[2]。(3)结核病死亡人数多,其死亡率仅次于艾滋病。(4)耐药结核病患者多:耐药率高达6.8%[2]。(5)农村结核病患者多:农村地区患病率约为城镇地区的1.6倍,农牧民占所有患病人数的61.79%,还有4.09%是农民工[2]。(6)传染性肺结核疫情居高不下,而西部12个省、市、自治区的疫情尤为严重,西部地区传染性肺结核患病率约为中部地区的1.7倍和东部地区的2.4倍[2]。根据2000年全国第四次结核病流行病学调查对新疆维吾尔自治区的抽样分析,结核病疫情南疆高于北疆,农村高于城市,少数民族高于汉族。2000年新疆汉族患病率464/10万,涂阳率是160/10万,死亡率是38/10万;新疆少数民族地区患病率是4551/10万,涂阳率是1791/10万,死亡率是180/10万[3]。

对象和方法

一、对象

1.病例组:从2008年6月至2008年10月新疆维吾尔自治区阿克苏市第二人民医院(原阿克苏地区传染病医院)和阿克苏地区温宿县人民医院确诊的维吾尔族结核病患者226例;其中男100例,女126例,平均年龄(43.8±25.7)岁。

2.对照组:根据病例-对照研究成组匹配的原则收集同一居住地区、同民族的均为有Mtb接触史的健康体检者(有卡痕者PPD硬结反应平均直径≥10mm,无卡痕、无BCG接种史者PPD硬结反应平均直径≥5mm)共231例;其中男107例,女124例,平均年龄(44.8±26.3)岁。

经χ2检验,病例组和对照组的性别构成比差异无统计学意义(表1),说明两组间具有较好的可比性(χ2=0.123<χ20.05=3.84,P>0.05)。

表1 病例组与对照组的性别构成比表

二、材料和仪器

蛋白酶K由Merck公司(德国)生产,三磷酸脱氧核苷(dNTPs),饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)由上海生物工程有限责任公司生产。DNA Marker和溴酚蓝由宝生物大连有限公司生产,引物由北京三博远志生物公司生产。主要仪器:-80℃超低温冰箱(SANYO/日本),BCD-218A 低温冰箱(海尔公司),SHH.W21恒温水浴箱(北京光明医疗仪器厂),MLS-3020高压蒸汽灭菌锅,NN-K653S微波炉(SANYO/日本),Bio-RAD梯度 PCR 仪(伯乐公司/美国),T-GRADIENT PCR 仪(Bio-RAD公司/美国),DYY-4型电泳仪(北京六一厂),TGL-16L型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

三、DNA提取的方法及纯度检测

从-80℃冰箱取出抗凝全血标本,于室温下融化;取200μl全血样品,加600μl细胞裂解液,混匀,再加入20μl蛋白酶K混匀,置37℃过夜或56℃水浴1~3h;加入500μl饱和酚-氯仿-异戊醇混合液,置于水浴好的Eppendorf管中,充分混匀,以保证DNA的完整性;置于离心机中,4℃,离心半径8cm,14 000r/min离心10min;取400μl上清液,移至盛有900μl预冷的无水乙醇的Eppendorf管中,轻轻混匀,-20℃冰箱中放置10~30min;离心半径8cm,14 000r/min,4℃离心10min,然后倒掉Eppendorf管中的液体,加入75%乙醇1ml洗涤1次;离心半径8cm,14 000r/min,4℃离心10min;离心结束后,倒掉乙醇,室温倒置Eppendorf管干燥30min;加入60μl TE缓冲液(10mmol Tris-HCl,1mmol EDTA,pH=8.0),轻轻振荡,或用移液器反复吸取吹打混匀,至完全没有未溶解物,4℃冰箱过夜,然后置于-20℃备用或-80℃冰箱保存。应用分光光度法测定碱基吸收紫外辐射的量。

四、引物的设计和合成

按照参考文献[4],分别设计针对野生型A等位基因的特异性反向引物MW,针对变异型B等位基因的特异性正向引物MU,及通用引物对MGFMGR。4条引物在同一体系反应,MW-MGF、MUMGR、MGF-MGR 可以分别配对,MGF-MGR通用引物对作为特异性引物扩增的内对照,以MW-MGF、MU-MGR引物对扩增片段的有无来判断该位点的基因型。

应用Primer软件设计MBL基因A/B位点分型使用的特异性及通用引物。引物由上海生工生物技术有限公司制作合成,序列详见表2。

表2 MBL基因A/B位点分型使用的特异性及通用引物

五、A/B位点的SSP-PCR(聚合酶链反应-序列特异性引物)反应条件

本研究PCR采用25μl PCR反应体系循环35次,具体情况详见表3、4。

表3 A/B位点SSP-PCR反应不同步骤使用的扩增条件

表4 A/B位点不同试剂扩增体系的组成

六、SSP-PCR扩增结果判定

取扩增产物5μl,与上样缓冲液(上样缓冲液×6)混匀,用2%琼脂糖凝胶电泳,100V,恒压,25min,电泳结束后于凝胶成像仪下照相。PCR产物在紫外灯下,每个泳道均显示429bp的内对照产物条带,与序列特异性引物发生反应的泳道,依次或同时出现阳性条带,然后根据与序列特异性引物反应的阳性条带,确定A/B位点基因型别。

七、SSP-PCR产物测序

PCR产物经凝胶电泳后,确定基因型别,从各基因型中随机(用SPSS 13.0软件进行随机抽取)抽取10%的PCR产物,送北京六合华大基因科技股份有限公司纯化并进行精确的核酸序列分析,以验证SSP-PCR分型结果。

八、统计分析

1.Hardy-Weinberg 平衡检验:Hardy-Weinberg平衡定律是指在一个随机婚配的大群体中,如果没有迁移、对一特定的遗传型没有选择作用、突变率保持恒定时,那么各种遗传型的比例将保持世代不变。该检验主要用于:(1)作为支持或排除某种遗传方式的一种提示;(2)用于估计群体调查资料的可靠性[5]。

2.A/B位点多态性与新疆维吾尔族人群肺结核易感性的关联分析:所有数据的统计分析均使用SPSS 13.0统计软件处理。采用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验,并比较病例组与对照组中等位基因频率(gene frequency,GF),GF=1-(1-f)1/2,f为该等位基因在人群中的百分比频率。以P<0.05为差异有统计学意义。用Haldane公式计算比值比(OR)[6],作为判定 MBL基因 A/B位点与结核病相关性的依据,计算公式为:OR=(ad)/(bc),式中a为携带某等位基因的患者数,b为不携带某等位基因的患者数,c为携带某等位基因的对照组人数,d为不携带某等位基因的对照组人数。

结 果

一、DNA抽提结果

采用酚-氯仿法对226例病例组和231例对照组的全血标本基因组DNA提取。所有样本的A260/A280>1.7,A260/A230>2.0,纯度达到试验要求。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳,电泳结果条带清晰明亮,所有样本全基因组DNA提取成功,结果见图1。

图1 全基因组DNA电泳图谱

二、PCR扩增结果

以基因组DNA为模板,应用序列特异性引物(表1)进行扩增,以2.0%的琼脂糖凝胶电泳。图2~4为检测结果。每一个反应管中均含有确定相应位点等位基因型别的特异性引物和内对照引物。每次PCR反应的结果判断必须在有内对照引物扩增条带出现的前提下进行。

MBL基因AB多态性位点MU、MGF、MW和MGR引物的扩增结果AB、AA、BB基因型如图2~4。

图4 MBL基因AB多态性位点MU、MGF、MW和MGR引物的扩增结果

三、PCR产物的测序结果

根据SSP-PCR后的电泳图来确定各标本的基因型,从各个基因型中随机(用SPSS 13.0软件进行样本的随机抽取)抽取10%的样本送北京一测序公司测序,结果如图5。

四、Hardy-Weinberg平衡分析

根据χ2=∑(期望值-观察值)2/期望值,求出A/B位点试验对照组的χ2值,计算其P值(表5)。

表5 不同基因型在病例组(226例)与对照组(231例)MBL-A/B位点等位基因频率比较

MBL基因A/B位点两组基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡定律,P>0.05说明样本基因型分布在病例组和对照组中是均匀的,所选择的人群具有群体代表性,可以进行下一步研究。

五、A/B位点多态性与新疆维吾尔族人群肺结核易感性的关联分析

图5 维吾尔族MBL基因AB位点测序图谱

AA基因型有106例,AB基因型有106例,BB基因型有14例;在231份对照组血液标本中,AA基因型有146例,AB基因型有80例,BB基因型有5例。突变频率为29.60%;根据优势比的假设检验公式Mantel-Haenszel卡方检验公式求出卡方值(表6~9)。

病例-对照研究中病例组与对照组的优势比等于追踪研究中暴露与不暴露的优势比,在发病率很低的情况,很接近追踪研究中的相对危险度,从表6~9可以看出AA基因型可能为结核病的保护性因素,BB基因型可能为结核病发病的危险性因素。病例组中 MBL-A/B基因频率显著高于对照组,两组的基因频率分别为6.20%、2.17%,差异有统计学意义(χ2=5.224,Pc<0.05)。

表6 不同基因型在结核病病例组(226例)与健康对照组(231例)MBL-A/B位点中的优势比

表7 不同基因型在结核病病例组(226例)与健康对照组(231例)MBL-A/B位点中的优势比

表8 不同基因型在结核病病例组(226例)与健康对照组(231例)MBL-A/B位点中的优势比

表9 病例组与对照组MBL-A/B位点基因型比较

本课题研究成果与国内其他研究维吾尔族[7]及国外部分人群MBL基因54位点密码子点突变频率[8-11](表10)比较发现:对新疆维吾尔族人群对照组其A/B位点突变基因频率分布与丹麦人群、英国人群、丹麦格陵兰岛自治区人群、德国人群,以及国内其他对维吾尔族的研究结果、汉族人群、回族人群、蒙族人群间比较,差异无统计学意义;与肯尼亚人群比较,差异有统计学意义;与冈比亚人群、纳米比亚人群比较,差异有显著统计学意义。

实验组其A/B位点突变基因频率分布与德国人群、国内其他对维吾尔族人群的研究结果、汉族人群、蒙族人群比较,差异有统计学意义;与我国回族人群,以及丹麦、英国、丹麦格陵兰岛、冈比亚、肯尼亚、纳米比亚人群比较,差异有显著统计学意义。

讨 论

当前结核病情的严重性在于一方面是结核病变得越来越隐蔽,已经有越来越多的人感染上更加强大的“耐药性病菌”,另一方面是已经很长时间没有发明有效治疗结核的药物,现在使用的是130年前的诊断方法、90年前的疫苗和45年前研发的药品,而面对的是不断变化不断严重的结核病疫情。从分子水平开始研究结核病发生发展的机制很有必要,为后续的分子伴侣对结核病的影响及Mtb的研究打下基础。

MBL血清浓度低下或MBL缺损主要受3个碱基多态性影响:MBL基因结构区外显子1密码子52的D、密码子54的B、密码子57的C。外显子1密码子52、54、57位的单碱基突变导致所编码的胶原区氨基酸分别由半胱氨酸(Cys)替代赖氨酸(Lys),天冬氨酸(Asp)替代甘氨酸(Gly),谷氨酸(Glu)替代甘氨酸(Gly)。这些替代可导致MBL三股螺旋胶原结构裂解,不能多聚化或形成畸变的MBL寡聚体,使蛋白极易降解。这3个位点相应突变的等位基因分别被命名为D、B、C,野生型为A[9]。有研究显示,世界大部分人群D、C突变频率为0,而A/B位点也就是54位的突变频率可以从10%到30%。

表10 各国研究人群MBL基因点突变频率的比较

国内外对MBL基因A/B位点的研究分析结果不一,可能与结核病血样难以收集,样本量的大小以及结核病群体分布不一样有关。本课题实验的样本来自226例维吾尔族结核病患者和231名维吾尔族健康人。在226份维吾尔族结核病患者血液标本中,AA基因型有106例,AB基因型有106例,BB基因型有14例,突变频率为6.20%;在231份对照组血液标本中,AA基因型有146例,AB基因型有80例,BB基因型有5例。与以前的对A/B位点的维吾尔族人群研究相比具有以下不同点:(1)可能由于样本量和群体分布量的不同,本课题研究出的对照组BB位点突变频率为19.99%,与国内其他人对新疆维吾尔族人群A/B位点的研究结果差不多,本课题研究出的实验组BB位点突变频率为29.60%,高于国内其他人对新疆维吾尔族人群A/B位点的研究结果[7]。(2)本课题研究得出AA基因型可能为结核病的保护性因素,BB基因型可能为结核病发病的危险性因素,结核病例组中 MBL-A/B基因频率显著高于健康对照组,两组的基因频率分别为6.20%、2.17%,差异有统计学意义 (P<0.05)。(3)本研究研究方法采用SSP-PCR法,在后续方法上可以采用原位杂交、Southern杂交、PCR-PFLP(限制性片段长度多态性技术)、PCR实时技术、MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)技术等实验加以验证。(4)MBL基因A/B位点的不同的等位基因型表达蛋白在结核病的不同类型中也可能存在差异,并且受到种族、地域及诊断标准等因素的影响。

关于基因多态性与疾病相关性的研究,往往需要大样本量才能保证研究结果的准确性和真实性以及关联分析的有效性,本研究的样本量较现有文献报道有所增加,但仍未达到能够进行较好重复的样本量要求;后续工作中,在按照纳入标准扩大样本量的基础上,采用病例-对照研究,可以应用基因敲除,基因缄默动物模型等分子生物学技术,论证MBL基因等结核病候选易感基因多态性与结核病的相关性,明确候选易感基因在结核病发生发展中所发挥的作用及其病理生理学机制,阐明MBL基因在抗结核免疫应答中的作用和结核病的发生机制,这将有助于制定结核病易感人群或高危人群的预防策略。同时,亦有助于结核病的辅助诊断、治疗及预后判断等。相信随着人类基因组研究的深入,群体遗传学和分子流行病学等学科的发展,可能为在基因水平阐明MBL与结核病关联的机制提供新的线索。

[1]李萍,贾天军,石万元,等.北方汉、回、蒙三民族健康人群MBL54,52,57位密码子基因多态性.广东医学,2008,29(1):57-59.

[2]中华人民共和国卫生部.卫生部介绍全国肺结核疫情状况现状[EB/OL].(2011-03-21)[2011-05-13].http://www.moh.gov.cn.

[3]金鑫,范新春,吴卫东.新疆维吾尔自治区第四次结核病流行病抽样调查报告.中国防痨杂志,2004,26(5):254-267.

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Correlation between MBL-A/B gene with the susceptibility of tuberculosis in Xinjiang Uighur population

ZHOU Jiang*,ZHANG Wan-jiang.Department ofPathophysiology,Medical School,Shihezi University/LaboratoryofXinjiangEndemic and Ethnic Diseases,Shihezi University,Shihezi 832002,China[*Postgraduation,Now worked at Ultrasound Department ofHubei Xiaogan Central Hospital,Xiaogan 432000,China]

ZHANG Wan-jiang,Email:zwj1117@sina.com

ObjectiveTo study the relationship between the polymorphism of the MBL gene and the susceptibility of tuberculosis(TB)in Xinjiang Uighur population. Methods The polymorphism of the MBL-A/B gene was analyzed by PCR-sequence specific primer(SSP)in 226patients with pulmonary TB and 231healthy controls who had a history of exposure toM.tuberculosisin Xinjiang Uighur population.The relationship between MBLgenotypes and the susceptibility of pulmonary TB was studied in accordance to the case-control study,and cases were grouped according to the genotypes. Results In the case group,AA,AB and BB genotypes at MBL gene A/B site were 106cases(46.90%),106cases(46.90%)and 14cases(6.20%),respectively.In the control group,AA,AB and BB genotypes were 146cases(63.20%),80cases(34.63%)and 5cases(2.17%),respectively.The frequency of BB genotypes at MBL gene A/B site in the case group was significantly higher than that in the healthy control group(6.20%vs 2.17%)(χ2=5.224,Pc<0.05). Conclusion AA genotype of MBL gene may be protective factor for TB,while BB genotype may be risk factor for TB in Xinjiang Uighur population.

Tuberculosis,pulmonary;Mycobacterium tuberculosis; Mannose-binding lectin; Polymerase chain reaction; Genetic predisposition to disease; Xinjiang

国家自然科学基金 (30960355)

832002石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室[周江(研究生,现在432000湖北省孝感市中心医院超声科工作)、张万江]

张万江,Email:zwj1117@sina.com

2011-11-07)

(本文编辑:薛爱华)

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