利用3对SSR标记鉴定两优287种子纯度及对杂株类型的定量分析

郭承亮，耿月明

（湖北省种子集团有限公司，湖北 武汉 430070）

种子纯度是种子质量的一个核心指标，是企业购销种子的关键依据，也是企业生存之根本。种子纯度检测主要有海南大田种植鉴定（以下简称“南鉴”）、大田正季种植鉴定（以下简称“正鉴”）以及SSR分子标记鉴定等方法。三种方法各有特点：“南鉴”和“正鉴”是以田间种植方式，从植株的典型特异性判别、鉴定种子纯度。“南鉴”具有鉴定相对准确、时间上相对提前的优点，但海南冬季属短日低温条件，感光类型及两系不育系表现正常结实，两系杂交水稻种子纯度鉴定结果往往失真；“正鉴”具有鉴定准确、鉴定结果与大田生产吻合度高的优点，但时间明显滞后，从历年发生的重大种子质量事件来看，绝大多数是在得知种子纯度不合格之前种子已经销售到千家万户无法“召回”，最终酿成无法挽回的损失。SSR分子标记是检测DNA水平上的生物个体差异，由于具有数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、不受环境条件影响、实验操作简单等特点广受重视；可以将呈父母本互补带型的杂交种与其双亲、甚至一些异源花粉造成的杂交种区分开，因此成为品种鉴定的理想分子标记，在杂交水稻种子纯度鉴定研究中得到了越来越广泛的应用[1～4]。在目前的实验操作中，由于受单个标记检测的局限性，不能将一些杂株以及一些异源花粉造成的杂交种区分开。本研究首先利用24对SSR标记对两优287及其大田正季鉴定中的9种杂株类型进行特异性分析，最终筛选出可将杂株类型相对区分开的3对SSR标记，并利用其对正季鉴定中的同一份样本进行分析，鉴定出的种子纯度及所含杂株类型比例与大田正季鉴定中的结果基本吻合。本研究通过多对标记对杂交水稻种子同一份样本进行纯度鉴定以及杂株类型定量分析，系统比较了两种方法的鉴定结果，并分析了检测结果的差异性原因，为公司两优287种子的销售提供了质量保证。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

本研究包含2个试验：试验一中的杂株类型来自正季鉴定中收集的9种杂株类型，试验二所用样品为正季鉴定材料中的同一份样本。

1.2 实验方法

1.2.1 试验一：在湖北省种子集团有限公司鄂州基地正季种植并按照当地栽培管理方法栽培两优287样品，调查杂交稻表型性状，并统计杂株类型和田间调查鉴定结果。取正季鉴定中9种杂株类型与杂交种F1，取其叶片参照CTAB法[5]提取DNA，按照PCR扩增10μL体系：1 μL DNA 模板， 1 μL 10×PCR buffer，0.8 μL 25 mmol的 MgCl2，0.2 μL 的 10 mmol dNTP，0.1 μL 的10 μmol正 向 引物 （primer F），0.1 μL 的 反 向引物（primer R），0.2 μL rTaq 酶 （Takara，5 U/μL），6.6 μL灭菌ddH2O。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，32～35个循环，每个循环94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，然后72℃延伸7 min。PCR电泳检测：采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.2 试验二：取正季鉴定中同一份样本的1920粒水稻种子，采用简易法提取DNA[6～9]：剪取0.5 cm长的水稻幼苗（幼叶或幼茎），放入96PCR板的孔中，每孔加入 40μL 0.25 mol/L的 NaOH,在沸水中煮 30 s，然后加入 40μL 0.25 mol/L的 HCl和 20μL 0.5 mol/L的Tris（pH 8.0,含有体积分数为0.25%的IGEPALCA630）的混合液,在沸水中煮沸 2 min，用1μL进行PCR扩增，其余4℃保存。然后按照试验一中的方法进行。

2 结果和分析

2.1 试验一鉴定结果

通过田间调查鉴定了两优287杂交稻材料的纯度，选取其中的9种杂株类型，包括不育系9802 s、父本、紫秆红稃尖、变异株1（比两优287矮）、变异株2（比两优287高）、紫秆迟熟株、迟熟株1（迟熟25天以上）、迟熟株2（迟熟15天左右）、青稞，归类并统计杂株总数及所占比例，结果见表1。

2.2 试验二纯度鉴定及对杂株类型分析结果

利用24对SSR标记对两优287大田正季鉴定中的这9种杂株类型进行差异化分析，最终筛选出3对SSR标记RM19、RM71、RM224可以将这9种杂株类型相对区分开：通过RM71可以鉴别4和5（变异株1和变异株2）以及7（紫秆迟熟株）；通过RM19可以鉴别1（不育系）；通过RM71与RM19同时可以将3和6归在一起鉴别出来；通过RM71、RM19、RM224可以将2、8、9分别鉴定出来，结果见表 1。

表1 两系杂交水稻种子纯度大田正季鉴定和三对SSR标记鉴定结果

2.3 试验一与试验二纯度鉴定及杂株类型分布结果比较

通过3对SSR标记和田间调查，鉴定了两优287杂交稻材料的纯度并对杂株类型进行定量分析 （见表1），结果表明，经过多对SSR标记检测的纯度为96.61%，而田间调查鉴定结果为97.10%，分子标记检测和田间调查鉴定结果基本吻合，各种杂株类型的分布基本一致，但是通过分子标记检测到0.31%的其它基因型的杂株。

3 讨论与结论

本研究结合大田正季种植鉴定，利用多对SSR标记系统分析了两优287纯度、各杂株类型相互间的区别并对样本进行分析统计。按照需求，选取了其中的3对SSR标记，可以将9种杂株类型全部鉴定出来并相对应归类。研究还发现，利用多对SSR标记鉴定的结果与大田正季鉴定的结果基本一致，各种杂株类型所占的比例也基本一致。但是通过3对SSR标记鉴定分析，还发现与9种杂株类型的基因型不一致的其他一些基因型杂株，对这些基因型所代表的杂株表现型还有待在正季鉴定中进一步研究。

本次研究对同一份样本采取两种鉴定方法鉴定种子纯度，产生一定的差异。研究认为，造成多对SSR标记鉴定纯度偏低的主要原因是：有一些杂株在正季鉴定中不表现出杂株表现型，而SSR标记能较明显的显示出是杂株，3对SSR标记检测中发现有0.31%的其它杂株类型的基因型。其次，两优287的父本在大田正季鉴定中也较难以明显鉴定出来，所以也导致大田正季鉴定的父本所占比例较SSR标记鉴定的结果低0.12%。

本研究是本公司利用自己建立的生物实验室，结合企业所在制种基地的实际生产情况，将两优287大田制种和SSR标记试验纯度鉴定结合起来进行分析比较，首次尝试采用多对SSR标记精确鉴定两优287的种子纯度及所含杂株类型定量分析。我们下一步拟采用这种方法，对每一个品种所有的杂株类型进行SSR标记特性分析，初步建立每个品种的SSR标记指纹库，然后结合大田制种的实际情况，选取几对SSR标记进行种子纯度及杂株类型定量分析，确保公司种子安全。

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