三阴性乳腺癌COX-2，VEGF表达相关性及临床意义研究

马 涛， 陆肖玮， 丁 云

三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)被认为是一种独立的临床病理类型，具有侵袭性强、预后差的特点，已经成为国际上乳腺癌研究的新热点。研究证实COX-2和VEGF在乳腺癌的发生和发展中起着非常重要的作用，本研究通过免疫组化的方法分析COX-2和VEGF在三阴性乳腺癌的表达情况，并与非三阴性乳腺癌的表达情况进行比较，评价他们在三阴性乳腺癌中的意义。

1 材料和方法

1.1 标本来源 收集我院2006年1月到2009年12月行乳腺癌根治术的219例癌组织标本，术前均未行放化疗。根据我院免疫组化结果，ER和PR阳性是指免疫组化染色阳性细胞在10%以上者，HER2根据《乳腺癌 HER2检测指南》标准［1］，－ ～+为阴性，+++者阳性，++者再用色素原位杂交法进行验证。其中三阴性乳腺癌42例，平均年龄53.5岁;非三阴性乳腺癌177例，平均年龄59.3岁。

1.2 实验方法 COX-2、VEGF、D2-40的检测应用免疫组化S-P法，鼠抗人COX-2单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人D2-40单克隆抗体均购自Santa Cruz公司，SP试剂盒购自北京中山公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。实验时用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的结肠癌 COX-2、VEGF阳性片和D2-40阳性表达的扁桃体组织切片作阳性对照。

1.3 结果判断标准 COX-2和VEGF阳性染色主要定位于细胞浆。将乳腺癌组织标本脱水固定，应用免疫组织化学染色(链霉菌抗生物素蛋白——过氧化酶-SP)法检测，用已知的阳性组织切片做阳性对照，用PBS作阴性对照，用DAB染色。胞浆棕黄色颗粒沉着的为阳性细胞。读片时每张切片分别取上、下、左、右及中心共5个区域的细胞计数，每个区计数200个肿瘤细胞，共计数1 000个细胞，计算染色细胞所占比例，阳性细胞＜10%为表达阴性，≥10%为表达阳性，不考虑染色的强度。

淋巴管密度(lymph vessel density，LVD)的计数按参考文献［2］:D2-40染色棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为1个淋巴管计数，首先在低倍镜下选择淋巴管密度最高的区域，然后在200倍光镜下随机计数5个视野内淋巴管数，再求其平均值。D2-40染色阳性的管腔内见到至少一个癌细胞就判断为淋巴管浸润(lymph vessel invasion，LVI)。

1.4 统计学分析 应用SPSS10.0统计软件包进行数据统计，数据比较应用 t检验，χ2检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三阴性和非三阴性乳腺癌COX-2和VEGF的表达与临床病理的关系(表1) 本组219例乳腺癌标本中42例为三阴性乳腺癌，占19.2%，非三阴性乳腺癌177例，占80.8%。42例三阴性乳腺癌标本中COX-2的阳性表达率为66.7%(28/42)，VEGF的阳性表达率为59.5%(25/42)，与患者的发病年龄、肿瘤大小、病理类型和临床分期无相关性(P＞0.05)，而与淋巴结转移、淋巴管浸润有关(P＜0.05)。177例非三阴性乳腺癌COX-2阳性表达率为52.0%(92/177)，VEGF 的阳性表达率为 40.7%(72/177)，同样与患者发病年龄、肿瘤大小、病理类型及临床分期无明显相关性(P＞0.05)，而与淋巴结转移、淋巴管浸润有关(P＜0.05)。

表1 三阴性与非三阴性乳腺癌病理特点及COX-2和VEGF的表达

2.2 三阴性和非三阴性乳腺癌COX-2和VEGF表达与淋巴管密度的关系(表2)COX-2和VEGF的阳性表达在三阴性和非三阴性乳腺癌中都与淋巴管密度相关，COX-2阳性组淋巴管密度明显高于COX-2阴性组;VEGF阳性组淋巴管密度亦明显高于VEGF阴性组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。但在三阴性乳腺癌同非三阴性乳腺癌之间，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表2 三阴性与非三阴性乳腺癌COX-2、VEGF表达与淋巴管密度的关系±s，支/mm2)

表2 三阴性与非三阴性乳腺癌COX-2、VEGF表达与淋巴管密度的关系±s，支/mm2)

COX-2+－P VEGF+－P 5.29 ＜0.05非三阴性乳腺癌 11.62±4.92 7.79±4.81 ＜0.05 12.79±5.54 8.51±三阴性乳腺癌 12.84±5.49 8.45±5.10 ＜0.05 14.14±5.68 9.65±5.25 ＜0.05

2.3 非三阴性乳腺癌 COX-2和 VEGF的表达与ER、PR和HER2表达的关系(表3) 在非三阴性乳腺癌中，COX-2和 VEGF的表达与 ER、PR和HER2的表达均无相关性(P＞0.05)。

表3 非三阴性乳腺癌COX-2、VEGF表达与ER、PR、HER2表达的相关性

2.4 三阴性乳腺癌中COX-2与VEGF表达之间的比较(表4)COX-2与VEGF具有相关性(P＜0.05)。

表4 三阴性乳腺癌COX-2与VEGF相关性

2.5 COX-2和VEGF在三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌中的表达情况(表5)COX-2在三阴性乳腺癌的阳性表达率为66.7%，高于非三阴性乳腺癌的52.0%，但两者差异无统计学意义(P＞0.05)。VEGF在三阴性乳腺癌的阳性率为59.5%，在非三阴性乳腺癌的阳性率为40.7%，两者差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表5 三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌COX-2和VEGF表达率的比较

3 讨论

COX-2是一种膜结合蛋白酶，可能通过促进新生血管生成、肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促进播散潜能而促进肿瘤的发生、发展［3］。在乳腺癌患者中COX-2往往高表达，且与预后相关［4］。VEGF是一种特异性促使血管内皮细胞增殖的有丝分裂原，在多种实体恶性肿瘤中高表达，并且在恶性肿瘤的生长、发展和转移过程中起重要作用［5］。本研究显示，在三阴性乳腺癌中，COX-2和VEGF基因均有高表达，而且与淋巴结转移、淋巴管密度和淋巴管浸润有显著相关性，与发病年龄、肿瘤大小、病理类型和临床分期无明显相关性。同时本研究结果还提示，COX-2基因和VEGF基因在三阴性乳腺癌中的表达具有显著的相关性。这可能与COX-2与VEGF具有协同作用并共同参与一些病理、生理过程有关。有报道证实COX-2能通过上调VEGF的表达从而促进血管的生成［6］。提示COX-2和VEGF的阳性表达在三阴性乳腺癌淋巴转移方面起到一定的协同作用。

本研究中，COX-2在三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌中均高表达，分别为66.7%和52.0%，且差异无显著性。分析原因，可能由于COX-2是乳腺癌比较普遍的基因表达产物，参与乳腺癌发生发展的多个方面，因此在三阴性和非三阴性乳腺癌中均有较高表达。VEGF在三阴性乳腺癌中的阳性表达率(59.5%)显著高于非三阴性乳腺癌的40.7%，这与Linderholm等［7］的报道相一致。说明VEGF与三阴性乳腺癌早期转移等恶性行为的联系更加紧密，VEGF的高表达更有意义。在非三阴性乳腺癌中，COX-2和VEGF基因的表达与ER、PR和HER2的表达无显著相关性，与淋巴管密度和淋巴管浸润相关，可能与三阴性乳腺癌的高局部复发和远处转移率有关。

三阴性乳腺癌患者既不能接受ER、PR阳性的内分泌治疗，也不能接受针对HER2阳性的靶向治疗，放化疗就成为术后治疗的主要手段。分子靶向治疗成为了研究的热点，但目前尚无标准的治疗方案［8］。COX-2与VEGF在三阴性乳腺癌中高表达，与淋巴结转移方面有关，有望成为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。

［1］《乳腺癌HER2检测指南(2009版)》编写组.乳腺癌HER2检测指南(2009版)［J］.中华病理杂志，2009，38(12):836-842.

［2］Schoppmann SF，Bayer G，Aumayr K，et a1.Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphovascular invasion in invasive breast cancer［J］.Ann Surg，2004，240:306-312.

［3］Solow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et a1.COX-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors［J］.Cancer，2000，89(12):2637-2645.

［4］Miglietta A，Toselli M，Ravarino N，et al.COX-2 expression in human breast carcinomas:correlation with clinicopathological features and prognostic molecular markers［J］.Expert Opin Ther Targets，2010，14(7):655-664.

［5］LeeSJ，Lee SY，JeonEON HS，et a1.Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and risk of primary lung cancer［J］.Cancer Epidermal Biomarkers Prey，2005，14(3):571-575.

［6］Guo GL，Yang GL，Li ZY，et a1.The effect of cyclooxygenase-2 on lymphangiogenesis in breast cancer［J］.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2008，46(2):132-135.

［7］Linderholm BK，Hellborg H，Johansson U，et al.Significantly higher levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)and shorter survival times for patients with primary operable triple-negative breast cancer［J］.Ann Oncol，2009，20(10):1639-1646.

［8］Freres P，Collignon J，Gennigens C，et al.“Triple negative”breast cancer［J］.Rev Med Liege，2010，65(3):120-126.