地黄不同种质资源产量和指标成分HPLC测定比较

李建军， 王 莹， 周延清， 李明军， 李景原

(河南师范大学 生命科学学院 河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心 河南 新乡 453007)

0 引言

地黄(RehmanniagtutinosaLibose)为玄参科多年生草本植物，是常用的补益中药，始载于《神农本草经》，列为上品.主产于河南、河北、山东、山西、内蒙古及东北，现全国大部分地区有栽培.河南怀庆府是地黄的道地产区，以温县、博爱、武陟、孟县等地产量最大.地黄具有滋阴清热、补血止血等功效，临床应用极为广泛.由于采收及炮制加工方法及药效的差异，地黄药材分为鲜地、生地和熟地.国内外对其化学成分、药理作用的研究已有较多的报道[1].

迄今为止，对于地黄的质量控制标准，尚无很完善的方法.一直以来常用梓醇作为地黄尤其是鲜地和生地的指标成分进行品质评价.2010年版《中国药典》把梓醇和毛蕊花糖苷都列为地黄指标成分，梓醇作为地黄的主要有效成分之一，具有降血糖、利尿和缓泻等作用[2-4]；毛蕊花糖苷作为地黄的主要有效成分之一，对神经系统、免疫系统具有明显的作用，特别是针对老年痴呆、慢性肾炎等疾病具有明显的治疗作用[5-7].根据药典规定并参考相关文献，作者研究了梓醇和毛蕊花糖苷的HPLC测定方法，进行了方法学考察，取得了比较满意的结果，并对9种主要地黄种质资源进行了梓醇和毛蕊花糖苷含量的分析比较,为良种繁育推广和新品种选育提供相关数据支撑[8-9].

1 材料和方法

1.1 材料

2010年11月采自封丘地黄资源圃中，9个主要种质资源经河南师范大学李发启副教授鉴定,采用同样的烘干粉碎方法获得样品.

1.2 仪器与试剂

Agilent 1200系列高效液相色谱仪，G1311A四元泵，自动控温自动进样器，G1316A柱温箱，XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，FA2004N型电子天平、JH502型电子天平(上海精密科学有限公司)，Thermo自动双重纯水蒸馏器.乙腈、甲醇为色谱纯，其他为分析纯，水为二次蒸馏水；梓醇标样(苹壹生物)，毛蕊花糖苷标样(四川维克奇生物科技有限公司).

2 实验方法

2．1 梓醇

2.1.1色谱条件 以乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)为流动相；检测波长为210 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL.

2.1.2对照品溶液的制备 精密称取梓醇对照品4.65 mg，置5 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀.

2.1.3供试品溶液的制备 精密称定烘干粉碎后的地黄粉0.8 g，置锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流提取1.5 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，浓缩至近干，残渣用流动相溶解，转移至10 mL量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

2.1.4测定法 对照品与供试品溶液各进样10 μL进行液相色谱分析.按外标峰面积法计算梓醇的含量.

2.3.3 监护时间 患者在ICU滞留时间越长，与外界隔离时间越长，ICU环境及各种社会心理因素对患者的刺激就越大，患者由此而产生的不良情绪也越多，其发生ICU综合征的概率也就越大。熊涧秋等［21］对430例体外循环术后ICU患者分析表明，滞留时间≥5 d的289例患者中有76例(26.3%)发生ICU综合征，滞留时间＜5 d的141例患者中有17例(12.06%)发生ICU综合征。提示患者滞留时间越长，其ICU综合征发生率越高。

2.1.5线性关系 精密吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置2 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀.将各个浓度的对照品溶液进样10 μL进行液相色谱分析.以梓醇对照品质量浓度为横坐标，梓醇峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y=2 296.3X-19.817，r=0.999 9，梓醇在0.465～4.65 μL线性关系良好.

2.1.6精密度试验 取同一对照品溶液，按含量测定方法及色谱条件进行测定，重复5次测定梓醇峰面积，RSD为0.19%.表明仪器精密度良好.

2.1.7稳定性试验 取对照品溶液及供试品溶液，于室温分别放置0、2、4、8、10 h，按上述色谱条件进样10 μL，测定梓醇峰面积，对照品及供试品的RSD分别为0.83%和0.76%.结果表明对照品及供试品溶液在10 h内稳定.

2.1.8重复性试验 精密称取同一批地黄样品3份，按含量测定方法进行测定，样品的梓醇平均含量为1.47%，RSD为3.82%.表明本实验方法重复性良好.

2.1.9数据处理 试验数据采用Excel和SPSS统计分析软件进行计算和分析，以平均值±标准差来表示结果.

2.2 毛蕊花糖苷(麦角甾苷)

2.2.1色谱条件 以乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84)为流动相；检测波长为334 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL.

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品8 mg，置50 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液.

2.2.3供试品溶液的制备 精密称定烘干粉碎后的地黄粉0.8 g，置锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流提取1.5 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，浓缩至近干，残渣用流动相溶解，转移至5 mL量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

2.2.4测定法 对照品与供试品溶液各进样10 μL进行液相色谱分析.按外标峰面积法计算毛蕊花糖苷的含量.

2.2.6精密度试验 取同一对照品溶液，按含量测定方法及色谱条件进行测定，重复5次测定毛蕊花糖苷的峰面积，RSD为0.97%.表明仪器精密度良好.

2.2.7稳定性试验 取对照品溶液及供试品溶液，于室温分别放置0、2、4、8、10 h，按上述色谱条件进样10 μL，测定毛蕊花糖苷峰面积，对照品及供试品的RSD分别为0.047%和0.23%.结果表明对照品及供试品溶液在10 h内稳定.

2.2.8重复性试验 精密称取同一批地黄样品3份，按含量测定方法进行测定，样品的毛蕊花糖苷平均含量为3.95%，RSD为0.62%，表明本实验方法重复性良好.

2.2.9数据处理 试验数据采用Excel和SPSS统计分析软件进行计算和分析，以平均值±标准差来表示结果.

3 结果与分析

3.1 同一产地不同地黄种质资源产量的比较

在同一产地，分别随机选取5个点，每个点按行连续取10株，测每个品种的单株鲜重，见图1.

图1 不同品种地黄产量比较Fig.1 Comparative studies on the strains of cultivars of Rehmannia

由图1可知,9个品种(系)单株产量中，沁怀单株产量最高，且沁怀>北京3号>生津>怀地3号>脱毒苗85-5>85-5>怀地1号>北京1号>怀地2号.经SPSS分析，沁怀与北京3号差异不显著，与其他品种差异极显著，脱毒苗85-5和85-5在产量上差异不显著.

3.2 同一产地不同地黄种质资源样品中梓醇含量测定结果

以同样的色谱条件分析梓醇标准品和样品，得到各样品的梓醇含量见表1，高效液相色谱图如图2所示.

表1 样品中梓醇含量测定结果Tab.1 Results of catalpol content in the samples

由表1可知：9个地黄样品梓醇含量差异明显，其中沁怀最高为3.70%，怀地1号最低为2.23%，均高于2010年药典规定，且沁怀3.70%(对照)>怀地3号3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津2.91%(P<0.01)>北京3号 2.55%(P<0.01)>怀地2号 2.31% (P<0.01)>脱毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1号 2.25%(P<0.01)>怀地1号 2.23%(P<0.01);脱毒苗85-5样品梓醇含量低于非脱毒苗85-5的梓醇含量，且差异极显著，有关机理有待进一步研究.由图2各样品的色谱图的峰面积大小，也可以直观地反映出样品之间的差异.

3.3 同一产地不同地黄种质资源样品中毛蕊花糖苷含量测定结果

以同样的色谱条件分析毛蕊花糖苷标准品和样品，得到各样品的毛蕊花糖苷的含量见表2，高效液相色谱图如图3所示.

由表2可知，9个地黄品种样品毛蕊花糖苷的含量差异明显，其中85-5最高为0.13%，北京3号最低为0.03%，毛蕊花糖苷含量均都高于2010年药典规定，且85-5 0.13%(对照)>北京1号 0.12%(P>0.05)>怀地2号 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>怀地3号0.08%(P<0.01)>怀地1号0.06%(P<0.01)>沁怀 0.04%(P<0.01)=脱毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3号0.03%(P<0.01)；脱毒苗85-5毛蕊花糖苷含量小于85-5，且差异极显著，有关机理有待进一步研究．由图3各样品的色谱图峰面积的大小，可直观看出样品之间的差异.

图2 梓醇的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of catalpol

编号品种毛蕊花糖苷平均含量/%185-50.13±0.028aA2北京1号0.12±0.004abAB3北京3号0.03±0.001eF4生津0.10±0.004cBC5沁怀0.04±0.008deEF6怀地1号0.06±0.001dDE7怀地2号0.10±0.003bcBC8怀地3号0.08±0.007cCD9脱毒苗85-50.04±0.014deEF

图3 毛蕊花糖苷的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of verbascoside

4 讨论

根据大量文献报道，地黄指标成分含量差异较大，究其原因是地黄的品种及其生长环境、栽培措施、采样收集时间及加工炮制方法不同等综合因素造成的.本实验将不同种质资源栽种在同一块试验田中统一管理，并参照2010版《中国药典》方法及相关文献，采用高效液相色谱法测其成分，以尽量保证各品种的客观条件基本平行，使测定结果更客观、更真实地反映不同种质资源之间成分含量和产量的差异.

通过对地黄同一产地9个品种(系)的产量试验结果得出：沁怀>北京3号>生津>怀地3号>脱毒苗85-5>85-5>怀地1号>北京1号>怀地2号，从产量方面说明沁怀、北京3号、生津、怀地3号、脱毒苗85-5和85-5的产量比较高，可以在生产中推广.

2010年版《中国药典》将梓醇和毛蕊花糖苷纳入地黄主要指标性成分，并规定地黄中梓醇含量不得少于0.20%，毛蕊花糖苷含量不得少于0.020%.实验结果9个地黄资源样品梓醇含量范围在2.23%～3.70%，毛蕊花糖苷含量范围在0.03%～0.13%.两种指标性成分都远高于药典规定的最低含量，说明怀地黄资源品质比较好.

通过实验数据分析可知，地黄不同种质资源样品间指标成分含量差异明显.其中梓醇含量：沁怀最高为3.70%(对照)>怀地3号3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津 2.91%(P<0.01)>北京3号 2.55%(P<0.01)>怀地2号 2.31% (P<0.01)>脱毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1号 2.25%(P<0.01)>怀地1号 2.23%(P<0.01),毛蕊花糖苷含量：85-5 0.13%(对照)>北京1号 0.12%(P>0.05)>怀地2号 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>怀地3号0.08%(P<0.01)>怀地1号0.06%(P<0.01)>沁怀 0.04%(P<0.01)=脱毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3号0.03%(P<0.01).

综合实验结果分析可知，地黄产量与其指标成分含量之间没有相关性，地黄不同种质资源样品中2个指标成分含量之间没有相关性；85-5、生津、沁怀、怀地3号和北京1号都可以作为品质育种的亲本材料；指标成分脱毒85-5明显低于85-5且差异极显著，究竟是什么原因造成其次生代谢产物差异的，机理有待进一步研究.

参考文献：

[1] 张留记，屠万倩．怀地黄品种比较和质量研究[J]．河南农业科学，2007(3)：101-102．

[2] 王敏，刘红彦，黄璐琦，等．道地产区地黄不同品种含梓醇量的比较[J]．中草药，2002，37(3)：444-446．

[3] Li Junping，Zhou Foujun，Jia Jianwei,et al．Effects of different store time and condition on the contents of catalpol in Rehmannia glutinosa[J]．Chin Tradit Herb Drugs，2003，34(3)：273.

[4] 王太霞，李景原，胡正海．怀地黄营养器官中梓醇的积累动态[J]．中草药，2004，35(2):208-209．

[5] 李勇，孙秀燕，林翠英,等.3个品种莪术挥发油化学成分的比较[J]．中草药，2005，36(12)：1785-1787．

[6] 尹明，牟娟，肖华芬,等．HPLC法测定蜜桶花颗粒中毛蕊花糖苷的含量[J]．中药新药与临床药理，2008，19(6)：485-487．

[7] Wen Xuesheng，Yang Shiling，Wei Jianhe，et al．Textual research on planting history of Rehmannia glutinosa and its cultivated varieties [J]．Chin Tradit Herb Drugs，2002，33(10)：946-949．

[8] 赵素荣．地黄梓醇提取分离工艺及其生物活性研究[D]．北京：中国人民解放军军事医学科学院，2006．

[9] 祁建军．地黄种质遗传关系及根际土壤微生物多样性研究[D]．北京：药用植物研究所，2007．