太极拳运动对中老年女性Th1/Th2平衡影响的机制研究

罗贝贝 王茹 陈佩杰

上海体育学院（上海 200438）

免疫老化是与年龄增长相关的免疫功能失调节，是机体正常衰老过程中的必经阶段。研究发现，辅助性 T 细胞（helper T cell，Th）亚群 Th1/Th2 失衡是老年期机体免疫机能衰退的现象之一［1］。太极拳是中华民族传统体育项目［2］，也是近年来上海市中老年女性参与人数最多的运动之一［3］。太极拳属于中低强度有氧运动，有增强体质、促进健康的积极效果［4］。关于太极拳运动对中老年女性免疫机能的研究多基于观察淋巴细胞［5］和固有免疫 细胞［6］数量和活性。我们前期研究发现，太极拳运动可提高Th1/Th2型细胞因子IFN-γ与IL-4分泌量比值［7］。那么，太极拳运动是否在基因表达水平上对Th1/Th2型细胞因子的分泌起调控作用？

大量研究发现调节性T细胞 （regulatory T cell，Treg）可在多种水平上调节Th细胞分化［8］。最近研究表明，外周血Treg细胞具有不同理化和免疫调节功能的细胞亚型，以应对多种炎症反应中特定的免疫环境［9］。研究报道太极拳运动对外周血Treg细胞的数量和功能有积极作用［10］。Treg细胞是否参与太极拳促进Th细胞向Th1细胞分化的过程？本研究从细胞因子角度在基因表达水平上研究太极拳运动改善老年性Th1/Th2失衡的机制，探索Treg细胞在太极拳运动中对Th1/Th2平衡的影响，为探讨运动过程中Treg细胞的免疫调节功能提供实验参考。

1 对象与方法

1.1 实验对象及分组

以健康讲座和居委会宣传等方式在上海市杨浦区殷行社区招募自愿者，通过问卷调查和体检进行筛选。实验对象纳入标准：（1）绝经后55～65岁中老年女性；（2）无太极拳或其他运动项目锻炼经验；（3）无免疫系统疾病病史；（4）无循环系统疾病病史；（5）无其他不适合进行运动的情况；（6）自愿参加本次实验。符合纳入标准的自愿者共41名，其中7名因搬迁或生病等原因退出，样本流失率为17.07%，完成全部指标检测的实验对象共34名。

采取随机分组方法，将实验对象分成太极拳组和对照组，基本情况见表1。实验前均告知实验内容，并签订知情同意书。所有指标均在上海体育学院运动人体科学实验中心检测。

表1 研究对象基本情况

1.2 运动锻炼计划

2009年11月至2010年5月，请我校武术学院教师和研究生前往受试者居住的社区指导太极拳锻炼。运动锻炼计划参照虞定海等研究［11］并结合实际情况进行修改。太极拳组进行每周3次、每次1小时的太极拳锻炼。锻炼主要内容为太极调息操、24式太极拳和42式太极拳。通过芬兰产Polar心率表和RPE 量表（Rating of Perceived Exertion Scales）监控各阶段运动负荷，运动心率控制在100～120次/分。前2周为适应性锻炼，春节放假6周，定期随访并要求受试者仍按照要求保持每周3次太极拳锻炼，进行运动强度监控与指导24周，总计32周。对照组不锻炼，保持原有生活状态。

1.3 血样采集与处理

对照组与实验组于实验前（2009年10月12日）和实验后（2010年6月11日）清晨空腹采血2ml，置于无菌肝素抗凝管内。取抗凝管内全血100 μl用于流式细胞术检测。剩余血样中加入溶血试剂（NH4CO335 mg，NH4Cl 3.5 g， 双蒸水500 ml，pH 7.35～7.45）分离白细胞，-80℃冻存。

1.4 主要试剂与仪器

试剂：流式抗体anti-human CD4-FITC、antihuman CD25-PE-Cy5、anti-human CD127-PE、antimouse IgG1-PE以及相关试剂ISOTONⅢ稀释液、Optilyse C红细胞裂解液均购自美国Beckman Coulter公司，逆转录试剂盒 （Fermentas RevertAidTMFirst strand cDNA Synthesis Kit K1621）购自美国Thermo Fisher Scientific公司，荧光定量PCR试剂盒（SYBRPremix Ex TaqTMDRR041A） 购自大连Takara公司，Trizol试剂购自美国Ivitrogen公司，溴化乙锭购自美国Amesco公司，DNA Ladder、Loading buffer、琼脂糖、DEPC水、TE缓冲液及50×TAE缓冲液均购自上海生工生物工程有限公司，无水乙醇、异丙醇、氯仿、NH4CO3、NH4Cl、生理盐水等常规试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司。

仪器：Epics XL流式细胞仪 （美国 Beckman Coulter公司），Rotor-Gene 3000实时荧光定量PCR仪 （澳大利亚 Corbett Research公司），Mastercycler gradient PCR仪、核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司），核酸电泳系统（美国Thermo Fisher Scientific公司），GDS-8000图像采集分析系统（美国UVP公司）。

1.5 Treg细胞的流式检测

早期实验常采用CD4+CD25+Foxp3+标记人Treg细胞。然而该方法仅适用于对小鼠Treg细胞的在体研究，且人体内表达CD4+CD25+Foxp3+的细胞并不仅仅是 Treg 细胞［12］。大量研究发现，使用 CD4+CD25+CD127low三标记法可提高人Treg细胞的检出数量［13］。故本研究选用CD4+CD25+CD127low标记检测Treg细胞在CD4+T细胞中的比例，荧光激发光波长为488 nm，PE及FITC荧光滤光片波长分别为575 nm和525 nm，分析系统软件为SystemⅡ。

1.6 RNA抽提与cDNA合成

使用异硫氢酸胍－氯仿经典法抽提总RNA，以电泳检验纯度。按Fermentas公司试剂盒说明书进行反转录，合成的cDNA储存在-20℃备用。

1.7 实时荧光定量PCR

引物设计与合成参考GenBank数据库公开序列，设计人目的基因 IFN-γ、IL-4、TGF-β1、CTLA-4、IL-10和管家基因GAPDH的引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2）。反应条件参考荧光定量PCR试剂盒说明，使用Rotor-Gene 6.0软件检测阈值（threshold cycle，Ct）与拷贝数对数呈线性关系，所有基因两者相关系数r2>0.99。使用绝对定量方法，根据标准曲线计算样本目的基因的表达量，再以样本自身GAPDH基因的表达量标准化。

表2 目的基因的引物设计

1.8 统计学分析

实验数据以平均值±标准差表示，用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。正态分布和方差齐性时，同组实验前后数据采用配对t检验分析，不同组数据采用独立样本t检验分析。P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Th细胞相关细胞因子mRNA表达

由表3可见，实验前，太极拳组与对照组外周血IL-4、IFN-γ mRNA 表达量及 IFN-γ mRNA 与 IL-4 mRNA表达量比值均无显著性差异（P>0.05）。实验后，太极拳组IFN-γ mRNA表达量显著上升 （P<0.01），IFN-γ mRNA与IL-4 mRNA表达量比值显著上升（P<0.05），而对照组 IFN-γ与 IL-4 mRNA表达量无显著改变（P>0.05）。

2.2 Treg细胞相关细胞因子和共刺激分子mRNA表达的变化

由表3可见，实验前太极拳组与对照组TGF-β mRNA的表达量无显著差异（P>0.05）。实验后，TGF-β mRNA表达量与对照组及自身实验前水平相比，均显著上升（P<0.01）。而对照组实验后TGF-β mRNA表达有所下降（P<0.05）。实验后太极拳组CTLA-4和IL-10 mRNA表达均显著上升（P<0.01）。

表3 Real-time PCR检测基因表达

2.3 Treg细胞比例的变化

由表4可见，实验前太极拳组与对照组Treg细胞占CD4+T细胞比例无显著性差异（P>0.05）。实验后，Treg细胞占 CD4+T细胞比例显著上升 （P<0.01）。

3 讨论

3.1 太极拳运动对中老年人Th1/Th2平衡的影响

太极拳对中老年人免疫系统机能有积极影响。刘静等发现，为期6个月的太极拳运动显著升高50～65岁中老年女性CD3+CD4+T细胞比例、CD4+/CD8+比值、NKT细胞比例、细胞因子IFN-γ和IL-4分泌量以及 IFN-γ 与 IL-4 比值［6，7］，从蛋白水平上证实了长期太极拳运动促进Th1型细胞因子IFN-γ的合成，使Th细胞分化向Th1方向漂移，改善老年性免疫失衡。

表4 Treg细胞占CD4+T细胞比例检测结果

本研究结果显示，32周太极拳运动提高中老年女性外周血白细胞Th1型细胞因子IFN-γ mRNA表达，提高IFN-γ mRNA与IL-4 mRNA表达量比值，同时在正常范围内增加Treg细胞数量。推测太极拳运动在基因水平上促进IFN-γ合成。此外，有研究发现IFN-γ可上调Treg细胞活性，诱导STAT1活化，有助于Treg细胞的发育和功能发挥［14］。王茹等研究发现，第1周跑台训练时大鼠IFN-γ分泌量和Treg细胞数量显著升高，但随着运动强度增加逐渐减少［15］。因此，太极拳运动增加IFN-γ mRNA表达，可能同时反馈促进了Treg细胞在体内发挥免疫调节的作用，维持中老年女性Th1/Th2平衡。

3.2 太极拳运动对中老年人Treg细胞的影响

有关太极拳运动对外周血Treg细胞影响的研究甚少。台湾Yeh等比较了12周太极拳运动前后37名中年受试者Treg细胞量及抑制性细胞因子含量，发现运动后Treg细胞数量显著增加，且Treg细胞活性增强，表现为TGF-β和IL-10等细胞因子显著升高［10］。张爱梅等检测了外周血CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的比例，发现60岁以上自愿者外周血Treg细胞占CD4+T细胞的比例显著低于20～59岁自愿者，提示Treg细胞数量随增龄降低［16］。本实验发现，实验前太极拳组和对照组Treg细胞占CD4+T细胞比例略低于张爱梅等实验中60岁以上组的数值［16］，可能由于采用的三标法（CD4+CD25+CD127low）检出率低于双标法（CD4+CD25+）；实验后太极拳组Treg细胞占CD4+T细胞比例显著高于对照组及自身实验前水平，接近张爱梅等实验中 20～59 岁组的数值［16］，提示长期太极拳锻炼可在正常范围内升高外周血Treg细胞数量。

Treg细胞发挥抑制作用主要通过分泌如IL-10和TGF-β等多种抑制性细胞因子，以及在胞膜上表达如CTLA-4等具有负性调节功能的共刺激信号分子［17］。TGF-β可抑制T细胞增殖，同时上调Treg细胞比例［18］。IL-10可通过影响Th2型细胞因子的产生等机制抑制高反应性的Th2细胞。CTLA-4是T细胞活化后诱导表达的负性调控因子，负向调节Th2细胞活化；同时诱导吲哚胺2,3-双氧合酶介导的色氨酸降解，从而促进Treg细胞新生［19］。本研究发现，实验后太极拳组TGF-β mRNA表达量与对照组及自身实验前水平相比均显著上升。TGF-β有膜型和可溶性两种形式，二者竞争性结合其受体，但实时荧光定量PCR检测不能区分。研究报道，健康受试者外周血TGF-β、CTLA-4和IL-10表达量呈相似趋势，均高于类风湿关节炎患者，表明TGF-β、CTLA-4和IL-10低表达可能参与了类风湿关节炎的发病进程［20］。因此，本研究仅针对太极拳组测定实验前后膜型共刺激信号分子CTLA-4和可溶性细胞因子IL-10 mRNA表达量。结果显示，实验后CTLA-4和IL-10 mRNA表达量均显著上升，提示长期太极拳锻炼能提高外周血Treg细胞的分泌功能。

然而，老年人体内Treg细胞数量累积或功能过度增强可能导致老年人患感染和肿瘤疾病的风险增加［1］。鉴于Treg细胞在机体免疫系统中的双重作用，在适当的范围内控制Treg细胞数量和功能，使Treg细胞发挥维持免疫自稳的积极作用，改善免疫老化导致的Th1/Th2失衡，从而延缓免疫系统衰老的进程，值得深入探索。

3.3 太极拳运动中Treg细胞维持Th1/Th2平衡的可能机制

外周Treg细胞可负向调节免疫反应的范围和持续时间，维持机体的免疫平衡状态。Treg细胞与CD4+T细胞比值是维持机体免疫平衡的重要指标，在免疫反应的持续性调节中起主要作用。Almeida等指出，Treg细胞与CD4+T比值下降导致机体免疫失衡，对Th细胞（尤其对Th2细胞）抑制作用明显减弱，使Th1/Th2平衡向Th2方向漂移［21］。研究发现，Treg细胞对Th2型淋巴细胞过度活化导致的炎症起抑制作用［22］；Treg细胞可促进Th2型淋巴细胞凋亡，但对其他Th细胞无此作用［23］；Treg细胞功能减弱与Th1/Th2失衡参与动脉粥样硬化等许多老年性疾病的发病进程［24］。

本实验结果表明，太极拳运动提高中老年女性外周血Treg细胞数量和抑制性细胞因子TGF-β、IL-10及共刺激信号分子CTLA-4 mRNA表达量，推断中小强度运动在正常范围内增加中老年女性外周血Treg细胞数量和相关细胞因子mRNA表达量，改善老年性Th1/Th2型细胞因子mRNA表达失衡。主要途径可能是：（1）在正常范围内升高Treg细胞数量占CD4+T细胞数量的比例；（2）增加Treg细胞细胞因子IL-10、TGF-β和共刺激信号分子CTLA-4 mRNA的表达。然而，本研究仅在基因表达水平上进行了初步探讨，今后还需在蛋白质和细胞水平上进一步阐明。

4 总结

太极拳运动影响外周血Treg细胞数量和相关细胞因子mRNA表达，提高中老年女性Th1/Th2型细胞因子mRNA表达量比值，在基因表达水平上改善以免疫机能向Th2漂移为主要表现的老年性Th1/Th2失衡。

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