保留与切除残迹前交叉韧带重建移植物形态学比较

孙磊 吴波 田敏 刘百川 罗永忠

中国人民解放军第八十八医院全军骨科中心（山东 泰安 271000）

前交叉韧带 （anterior cruciate ligament，ACL）损伤是常见膝关节损伤之一，常需手术重建。ACL重建研究热点主要着重于两方面，一是解剖学，二是生物学。解剖学方面基于对ACL解剖与生物力学特点的认识，设计ACL的重建技术方法，力求恢复ACL原有的尺寸、韧带走行方向和止点位置[1]。而生物学方面则关注ACL重建移植物与宿受区的愈合，无论采用何种重建移植物，只有移植物与宿主受区生物愈合，才能长久替代ACL功能。移植物关节内部分的愈合又称为“韧带化”，是一复杂的过程，移植物关节内部分要经历缺血坏死、再血管化、组织细胞增殖和塑型成熟4个阶段[2-4]。许多学者认为，原始ACL的残迹是ACL重建后移植物的再血管化、细胞增殖和神经再生的重要源泉[5，6]，因此，主张保留残迹 ACL重建的手术方法已有许多临床研究报道[7，8]，但鲜有相关动物实验研究[9-11]。本研究假设保留残迹可加快ACL重建移植物的再血管化和修复愈合过程，促进移植物的“韧带化”，建立保留与切除残迹兔ACL重建模型，观察比较两种ACL重建方式移植物愈合过程的形态学差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物与处理

4～6月龄健康新西兰兔30只，体重（2.62±0.24）kg，雌、雄各14只，由泰安米歇尔生物公司实验动物中心提供。本研究主要工作在我院中心实验室完成，实验动物使用许可证号：SYXK（军）2007-02。10%水合氯醛，2.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上。分别于跟腱外侧切开，切取跟腱外侧2/3，作为移植腱，将移植物修整至长5 cm，直径2.0 mm。两端编织缝合，保留尾线作为牵引线，置于生理盐水中备用。于膝关节外侧切开，将髌骨翻向内侧，显露关节，切断前交叉韧带。右膝为保留残迹组（remnant preservation，RP），保留股骨端和胫骨端各2 mm长的残迹；左膝为切除残迹组（remnant resection，RR），采用烧灼法完全切除上下端残迹。定位于原ACL残迹或印迹中央，用直径为2.0 mm的钻头，分别由外向内钻胫骨和股骨隧道。分别将移植物引入，拉紧移植物，于骨隧道外口处将移植腱与周围软组织缝合固定。检查见移植物张力适中，两端固定牢固，逐层缝合切口。术后后肢不予固定，分笼饲养。采用随机数字表将30只动物分为3组，每组10只，分别于术后4、8、12周行膝关节功能评分；处死动物后，行血管灌注大体形态观察与组织学观察。

1.2 观测指标

1.2.1 膝关节功能评分

按膝关节被动活动缺失、跛行程度、前抽屉试验稳定性进行评分，详见表1，最低得0分，最高9分。

表1 膝关节功能评分标准

1.2.2 血管灌注及大体形态观察

10%水合氯醛过量麻醉处死动物。开胸暴露心脏，直视下将注入管插入左心室，流出管插入右心房。首先灌注肝素生理盐水，灌注机转速180 r/min，当流出管液变清时，开始灌注4%甲醛500 ml，然后，再注入甲醛炭素墨水500 ml后停止。切开膝关节，观察重建ACL移植物大体形态与表面血管情况。清除膝关节周围关节囊、其他韧带和筋膜等，5倍解剖显微镜下采集重建ACL前、后、左、右4幅图像，输入计算机，Image-Pro Plus 6.0软件图像处理，分别计算重建ACL关节内段移植物表面血管面积和移植物面积（像素数），移植物表面血管密度=移植物表面血管面积/移植物面积。取4幅图像的平均值。

1.2.3 组织形态观察与评分

切取重建ACL移植物关节内中央5 mm段，10%多聚甲醛固定、10%EDTA脱钙。修整标本，脱水、透明、浸蜡、包埋，制备移植物中央部纵向5 μl的切片，分别行HE和Masson三色染色。在切片中央连续选取4个高倍镜视野 （×400），2名病理学医生在双盲条件下按表2分级标准进行组织学评分，取两人各4个视野的平均值。

表2 高倍镜下移植物中央部组织学评分标准（×400）

1.3 统计学分析

资料输入计算机，采用SPSS19.0软件进行统计学分析。各时间点内两处理组间计量资料分别行配对t检验，等级资料分别行配对Wilcoxon符号等级检验。整体资料采用2×3析因方差分析。选取α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝关节功能评分

表3显示，术后各时间点保留残迹组膝关节功能评分均高于切除残迹组，但两组间差异均无统计学意义（P>0.05）。2×3析因分析表明：保留残迹组和切除残迹组间膝关节功能评分差异无统计学意义（F=1.800，P=0.185）；不同时间点间差异无统计学意义（F=2.956，P=0.061）；移植处理与时间之间无交互作用（F=0.200，P=0.891）。

表3 两组术后各时间点膝关节功能评分比较（）

表3 两组术后各时间点膝关节功能评分比较（）

n ????? ????? Z? P?4? 10 7.90–0.88 7.70–1.06 0.7070.4808? 10 8.10–0.74 7.90–0.99 0.3510.72612? 10 8.70–0.48 8.10–0.92 1.3940.163

2.2 术后大体形态观察及移植物表面血管密度

术后4周，保留残迹组ACL残迹与移植物愈合，可见较多自残迹表面向移植物表面延伸的血管，残迹与移植物的边界清晰可辨，未见残迹形成“独眼畸形”；切除残迹组表面有少量新生血管。

术后8周，保留残迹组（图1a）小箭头示ACL残迹与移植物融合塑型，边界已模糊不清，无“独眼畸形”，大箭头示移植物表面有密集新生血管；切除残迹组表面新生血管较稀疏（图1b）。

术后12周，保留残迹组移植物塑型为近似ACL的结构，表面血管减少，难以分辨移植物与残迹，残迹已吸收，不可分辨（图1c）；切除残迹组移植物亦有塑型改建，表面血管稀疏（图1d）。

表4显示，术后不同时间点保留残迹组移植物表面血管密度均高于切除残迹组；4、8周时，两组间差异均有统计学意义（P<0.05），12周时，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。2×3析因分析表明：保留残迹组与切除残迹组之间移植物表面血管密度差异有统计学意义（F=32.037，P<0.001），不同时间点对比差异有统计学意义 （F=59.596，P<0.001）。移植处理与时间不存在显著交互作用（F=2.448，P=0.096）。

表4 两组术后各时间点移植物表面血管密度比较（）

表4 两组术后各时间点移植物表面血管密度比较（）

n ????? ????? t? P?4? 100.02912–0.001410.01606–0.007334.1570.0028? 100.04242–0.008050.03129–0.007402.8360.02012? 100.01706–0.005170.01269–0.005902.0030.076

2.3 组织学形态观察

术后4周，保留残迹组外周部（P）有大量新生血管和成纤维细胞，但中央部（C）新生血管和成纤维细胞数目较少（图2a），胶原纤维排列稍紊乱，密度较低，但仍呈波纹状排列（图2b）；相比之下，切除残迹组移植物外周部亦可见新生血管和成纤维细胞增生，但侵入移植物中央部的成纤维细胞更为稀少（图2c），胶原纤维排列更紊乱，更稀疏，未见波纹状排列（图 2d）。

图1 术后8周和12周移植物血管染料灌注大体形态

图2 术后4周组织学检查所见（×100）

术后8周，保留残迹组移植物内可见密集新生血管，伴有大量成纤维细胞增生，胶原纤维密度增加，但排列仍不规整；切除残迹组移植物内也有较多新生血管，成纤维细胞增生，胶原纤维密度有所增加，排列紊乱。

术后12周，保留残迹组移植物中央部新生血管密度减少，管腔增粗，成纤维细胞数量明显减少，胶原纤维致密，排列趋于规整；切除残迹组移植物中央部血管细小，成纤维细胞数量亦减少，胶原纤维较致密，排列欠规整。

表5显示，术后不同时间点，保留残迹组移植物中央部组织学评分均高于切除残迹组，4周、8周两组差异均有统计学意义（P<0.05），但12周两组间差异无统计学意义（P>0.05）。2×3析因分析表明：保留残迹组与切除残迹组之间组织学评分差异有统计学意义（F=18.150，P<0.001），不同时间点对比差异有统计学意义（F=67.817，P<0.001）。移植处理与时间不存在显著交互作用 （F=2.475，P=0.094）。

表5 两组术后各时间点高倍镜下移植物中央部组织学评分比较（×400）（）

表5 两组术后各时间点高倍镜下移植物中央部组织学评分比较（×400）（）

n ????? ????? Z? P?4? 10 4.00–0.67 2.80–0.92 2.203 0.0288? 10 7.60–1.07 5.90–1.29 2.459 0.01412? 10 6.60–0.70 6.20–0.79 1.000 0.317

3 讨论

功能评分是临床评价ACL重建效果的重要方法，主要有Lysholm评分、Tegner评分、IKDC主观评分与客观评级[12]。本研究对象为兔，无法进行主观评定。故我们依据容易观察的关节被动活动缺失、跛行程度、前抽屉试验稳定性三项客观指标进行评分，尽管不够精细，但可提供量化的膝关节功能信息。结果表明，虽然保留残迹组与切除残迹的功能评分差异无统计学意义，但保留残迹组功能评分有高于切除残迹组的趋势。这可能与保留残迹组ACL重建对关节内组织的干扰与损伤较轻有关，提示采用保留残迹技术重建ACL，减少对关节内组织的清创，有可能减轻术后局部反应，有利于术后早期功能恢复。

大体形态观察是评价移植物关节内愈合最直观的方法，临床多采用二次关节镜下观察评估[13，14]。 本研究为动物实验，在术后不同时间点再次切开关节进行细致观察。大体观察可见保留残迹组ACL残迹与移植物愈合，并逐步塑型融合，可见较多自残迹表面向移植物表面延伸的血管，未见残迹形成“独眼畸形”。独眼畸形是由于残迹纤维与髁间窝反复撞击以及胫骨隧道口周围软骨和骨碎屑沉积而增生形成纤维结节样包块，从而导致膝关节伸直功能受限[15]。本研究结果进一步佐证了 Cha 等[16]、Ahn 等[17]的临床研究结果，保留残迹ACL重建并未增加“独眼畸形”的发生。ACL重建移植物的再血管化是其愈合的关键过程，在关节内段，再血管化由两边向中央，由浅入深地发展。以往对移植物再血管化的研究主要采用组织学观察[18，19]。 李志超等[11]研究保留残迹 ACL重建的再血管化，采用了血管染料灌注后组织学观察，并未进行移植物表面血管再生的大体观察。本研究将血管染料灌注后大体形态与组织学观察相结合，更全面评估移植物的再血管化。结果显示，术后保留残迹组血管密度均显著高于切除残迹组，4周和8周时两组差异均有统计学意义。这提示原始ACL残迹是ACL重建移植物再血管化更直接的来源。换言之，保留残迹的ACL重建更有利关节内移植物的再血管化。

笔者[9]以往对保留残迹ACL重建的移植物组织学观察，李志超等[11]的研究主要以移植物内成纤维细胞计数评估移植物的韧带化进程，但ACL重建后关节内移植物愈合的组织学改变是一复杂的过程。王永健等[20]的研究表明，移植手术后第2周，可见关节腔内的肌腱组织坏死，表现为细胞核溶解，新生组织尚未长入替代；术后1月，见到有大量新生的细胞从移植物外周向中心长入，新生细胞呈梭形，较正常半腱肌腱和前交叉切带细胞的体积大；术后第2个月，关节腔中的移植物富含细胞，呈类圆形，胶原纤维排列无序；术后第4个月，移植物中细胞数目接近正常前交叉切带，细胞呈长梭形，胶原纤维纵向排列比较整齐。故本研究设计了组织学评分系统，依据高倍镜视野下新生血管计数、成纤维细胞计数和胶原纤维密度来综合评价移植物愈合程度。结果表明，术后不同时间点，保留残迹组中央部组织学评分均高于切除残迹组，4周和8周时两组差异均有统计学意义，但12周时两组间差异无统计学意义。本研究组织学结果与血管灌注大体观察所见吻合，提示保留残迹ACL重建可早期促进关节内移植物的愈合。

综上所述，本研究结果证实了笔者假设，保留残迹可加快ACL重建移植物的再血管化和修复愈合过程，促进移植物的韧带化。这归结于残迹为移植物愈合提供细胞、血管和神经再生的源泉。此外，在移植物再血管化这一关键过程中，局部血管内皮生长因子（VEGF），转化生长因子（TGF-β）等的表达具有重要作用[21，22]。Xie 等[23]比较了保留残迹、切除残迹ACL重建，以及假手术和正常ACL生长因子基因的表达，发现术后6周保留残迹组的COL1A1、COL3A1、TGF-β1和神经相关基因GAP-43表达均高于切除残迹组，术后12周保留残迹组VEGF mRNA水平亦高于切除残迹组，表明保留残迹ACL重建移植物加速韧带化与局部血管、神经等相关生长因子的优势表达有关。

本研究存在以下缺陷与不足：（1）本研究对象为兔，其膝关节结构及力学特点与人类有差异。（2）本研究着重观察了术后12周内关节内移植物愈合过程的大体形态与组织学，未观察移植物与骨隧道的腱－骨愈合。（3）对膝关节功能评分和移植物组织学评分标准不够精细。尽管如此，本研究还是提供了保留残迹对ACL重建移植物韧带化影响的有益信息。

4 总结

本研究结果证实保留残迹可加快关节内ACL重建移植物的再血管化和修复愈合过程，促进移植物的“韧带化”，为临床保留残迹ACL重建提供了实验依据。这提示ACL重建也应像骨折复位内固定一样遵循生物学原则，要特别注意保护局部原有残迹的血供与神经支配。

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