EDTA依赖性假性血小板减少的临床和实验室分析

李 波，史 敏，宋 军，高羽高，王 燕

（1.河北省石家庄市疾病预防控制中心预防性健康体检所，河北石家庄 050011；

2.河北医科大学第二医院检验科，河北石家庄 050000）

·论 著·

EDTA依赖性假性血小板减少的临床和实验室分析

李 波1，史 敏2*，宋 军2，高羽高2，王 燕2

（1.河北省石家庄市疾病预防控制中心预防性健康体检所，河北石家庄 050011；

2.河北医科大学第二医院检验科，河北石家庄 050000）

目的对乙二胺四乙酸依赖性假性血小板减少症（ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）患者进行临床和实验室分析，并初步探讨其产生机制。方法比较仪器法测定及手工法计数的血小板结果；采用瑞-姬染色法观察D抗凝和不抗凝血涂片中血小板形态；采用间接免疫荧光法检测免疫球蛋白抗体IgG、IgA和IgM。结果①EDTA-PTCP的发生率为1.17%，多发生于老年人，与性别无关，心血管疾病患者的发生率较高；②EDTA-K2抗凝血在血细胞分析仪上测定的血小板计数值［（41.15±19.1）× 109/L］明显低于手工法计数血小板计数值［（181.6±75.3）×109/L］（P＜0.05）；③假性血小板减少症（pseudothrombocyto penia，PTCP）患者EDTA抗凝血涂片与不抗凝血涂片中血小板形态明显不同；④PTCP患者多表达IgG或IgM抗血小板抗体。结论应用血细胞计数仪测定EDTA抗凝血可引起PTCP的发生，这可能与自身抗体IgG或IgM的存在有关。

血小板减少；血小板计数；抗血小板聚集抑制剂

KEY WORDS：thrombocytopenia；platelet count；platelet aggregation inhibitors

近年来，由多种原因引起的乙二胺四乙酸依赖性假性血小板减少症（ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTAPTCP）常见报道［1］。PTCP是一种由抗凝剂在体外激活血小板发生凝集反应，从而导致血小板计数假性降低的现象，本身并无病理意义［2］。EDTA盐能有效保持细胞形态和防止血小板聚集，是国内外全自动血液分析仪普遍采用的一种抗凝剂，但少数情况下有可能导致 PTCP，即 EDTA依赖性 PTCP（EDTA-PTCP）。对PTCP的认识不足常会导致不必要的实验室检测、延误治疗以及由此引发输血并发症［3］。为探讨其发生原因，本文对895例健康体检者及1 250例住院患者进行了血小板计数观察，并对其中出现EDTA-PTCP的25例患者进行了临床和实验室分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象：选取2008年3月—2010年3月住院患者1 250例，健康体检者895例，在进行血常规分析时，对血小板计数＜100×109/L的标本进行涂片镜检，其中镜检发现血小板聚集成团的，与计数明显不符的，即为EDTA-PTCP，定为实验标本。

1.2 方法：仪器包括全自动血细胞分析仪（CD3700，美国雅培公司），荧光显微镜（XSP-08/ YZ-1，日本OLYMPUS公司），光学显微镜（CX21，日本OLYMPUS公司），牛鲍计数盘（江苏盐城锦辉玻璃仪器厂），EDTA-K2真空采血管（威海鸿宇医疗器械有限公司），37℃温箱（无锡瑞智科技有限公司），搪瓷桶3只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1 500mL），有盖搪瓷盒1只（内铺一层浸湿的纱布垫），玻片架，滤纸。试剂包括全自动血细胞分析仪配套试剂，草酸铵稀释液，瑞-姬染液，磷酸盐缓冲液，0.01mol/L，pH7.4；缓冲甘油，分析纯无荧光的甘油9份和0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2）1份配制；荧光标记的多克隆兔抗人免疫球蛋白抗体（IgG，IgM，IgA）（Abcam公司），以0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液1∶200进行稀释。

1.2.1 仪器法：安静状态下顺利抽取5mL静脉血，其中2mL静脉血加入到EDTA-K2抗凝管中，立即混匀，1h内在血细胞分析仪上检测血小板计数；3mL静脉血静置2h，3 000r/min离心10min，留取血清检测血小板抗体。

1.2.2 手工法：取静脉血20μL加入到0.38mL草酸铵的稀释液中，按照《全国临床检验操作规程》第3版的操作方法进行血小板手工计数。

1.2.3 血涂片镜检：在抽取静脉血同时，取10μL血立即涂片，作为涂片A，再用EDTA-K2抗凝血进行涂片，标为涂片B，行瑞-姬染色后，在油镜下观察血小板分布情况。

1.2.4 间接免疫荧光法检测抗体：①滴加0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。②滴加以0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液200倍稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。③取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗1～2次，然后按顺序过0.01mol/L、pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。④取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴1∶200稀释的荧光标记的抗人球蛋白抗体。⑤将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。⑥重复操作3。⑦取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。⑧荧光显微镜高倍视野下观察。

1.3 结果判定：（ -）无荧光；（ ±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（ ++）荧光明亮；（+++ ～ ++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

1.4 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EDTA-PTCP的发生率及临床分析：1 250例住院患者中发生EDTA-PTCP 23例（1.84%），健康体检者895例中发生2例（0.22%），25例EDTAPTCP中，男性14例，女性11例，年龄25～71岁，平均52.4岁。其中＜40岁有8例，≥40岁17例；心血管疾病13例，恶性肿瘤2例，肝脏疾病4例，免疫性疾病2例，重症感染4例。

2.2 血小板2种计数方法的比较：使用EDTA-K2抗凝管在血细胞分析仪上测定的血小板计数值为（41.15±19.1）×109/L，手工法计数血小板计数值为（181.6±75.3）×109/L，EDTA-K2抗凝管血小板计数值明显高于手工法计数血小板计数值，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 血小板形态学检查：涂片经瑞-姬染色在油镜下观察显示，涂片A中血小板数量较多，呈自然成堆分布，且血小板形态清晰（图1A）。涂片B中血小板明显聚集成簇，甚至聚集成大片状，血小板数10～50个不等，且血小板形态模糊，边界不清，多融合在一起，易聚集于中性粒细胞周围（图1B）。

2.4 免疫球蛋白抗体的检测：IgG，IgM，IgA抗体在25例EDTA-PTCP患者中表达有所不同，其中IgG 8例，IgM 14例，IgA 3例。

图1 患者外周血血小板形态学A.不抗凝血血小板；B.EDTA抗凝血血小板Figure 1 Platelete morphology in patient′s peripheral blood smear A.non-anticoagulated blood；B.EDTA-anticoagulated blood

3 讨 论

本研究结果显示，在健康体检者和住院患者中EDTA-PTCP的发生率较少（1.17%），心血管疾病患者的发生率较高；PTCP患者EDTA抗凝血涂片与不抗凝血涂片中血小板形态明显不同；PTCP的发生机制可能与自身抗体IgG或IgM的存在有关。

血小板在体内主要参与止血与血栓形成，有着非常重要的生理功能，是临床最常用的检验项目之一，因此血小板数量检测的准确度至关重要。目前血小板的检测方法主要是应用血细胞分析仪对抗凝血进行检测。抗凝剂的种类多样，而EDTA-K2抗凝剂是国际血液标准化委员会推荐的首选抗凝剂，其不影响血细胞形态，并可抑制血小板的聚集，在血液分析仪中广泛应用。国外报道EDTA-PTCP的发生率为0.07% ～0.20%，住院患者的发生率为1.9%，而且未发现与年龄、性别有关［4］。PTCP的发生与临床用药治疗及机体自身情况有关。有研究［5］发现这种现象常发生于重症患者，与自身免疫疾病、肿瘤形成、心血管疾病或慢性肝脏病、病毒感染或脓毒症有关。本研究结果显示，住院患者PTCP的发生率为1.84%，健康体检者PTCP的发生率为0.22%，男性与女性的发生率相近，多为老年人；25例EDTA-PTCP患者中，心血管疾病13例，恶性肿瘤2例，肝脏疾病4例，免疫性疾病2例，重症感染4例。表明EDTA-PTCP多发生于老年人，与性别无关，心血管疾病患者的发生率较高。

本研究结果还显示，PTCP患者EDTA抗凝血涂片与不抗凝血涂片中血小板形态明显不同，EDTA抗凝血涂片中的血小板明显聚集成簇，甚至聚集成大片状，血小板10～50个，且血小板形态模糊，边界不清，多融合在一起，易聚集于中性粒细胞周围，而非抗凝血血涂片则为自然成堆分布。这可能与血小板结合的抗体Fc段和单核细胞或淋巴细胞膜上Fc受体结合有关。在这种情况下，很可能影响血细胞分析仪对血小板计数及白细胞的分类，导致血小板假性降低。所以，对于在机测血小板结果＜100× 109/L、且无明显的出血倾向如鼻出血、牙龈出血、紫癜、瘀点、瘀斑等体征且无法解释血小板减少原因的患者，做血涂片进行初步观察，如发现有血小板聚集、堆积和发生卫星现象等情况时，应采指血用毛细血管模式测定，或用显微镜手工计数检测，以得出真实性的血小板计数，为临床提供准确可靠的实验数据，避免因假性血小板减少所造成的误诊。

PTCP是由免疫学介导的，在血液学中存在EDTA依赖性抗血小板抗体而导致的血小板聚集现象。抗血小板抗体通常为IgG或IgM，很少为IgA，这些抗体可以与来自正常个体的血小板发生反应［6］。它们可能与某些隐藏的通常不能被检测到的表面抗原发生反应，主要表达于衰老或被破坏的血小板膜上。有研究［7］证实这些抗体不与患有Glanzamann′s病（即缺乏GpⅡb/Ⅲa复合物）的血小板反应，说明与EDTA依赖的抗体反应的物质应包含GpⅡb/Ⅲa。在一些患者中发现一些自身抗体可以特异性地与GpⅡb发生反应，GpⅡb通常隐藏在GpⅡb/Ⅲa复合物中，但经过EDTA与钙离子鳌和作用，GpⅡb/Ⅲa复合物分裂，GpⅡb暴露出来，与血小板抗体反应，这种现象与低温引起的血小板结构改变有关［8］。本研究对PTCP患者进行检测，发现存在抗IgG抗体者8例，IgM抗体10例，IgA抗体3例，大都表现IgG或IgM抗体，与文献报道一致［6］。提示 IgG或 IgM抗体的存在可能是发生EDTA-PTCP的机制之一。

综上所述，应用血细胞计数仪可引起PTCP的发生，可能与自身抗体IgG或IgM的存在有关。如果在临床工作中此种现象未被及时发现，往往会给患者的诊断和治疗带来诸多麻烦，甚至会引起医疗纠纷，因此及时发现尤为重要。这就需要检验工作者具备一定的责任心，当在临床工作中遇到血小板减少的患者时，首先应仔细检查人为因素和客观因素，排除采血不当、抗凝管用错等原因造成的血小板减少，其次做血涂片进行瑞-姬染色，观察细胞形态，一旦发现血小板聚集、堆积和发生卫星现象等情况，与机器计数明显不符，再做人工血小板计数。丁胺卡那霉素能有效解离凝集的血小板，作用机制可能与抑制患者血小板膜表面CD62p、PAC21和IgG的表达有关［9］，因此PTCP患者血常规样品抽血后1h内加入丁胺卡那霉素，有助于解决EDTA所致的血小板数的假性减少。

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（本文编辑：刘斯静）

THE CLINICAL AND LABORATORY ANALYSIS OF EDTA-DEPENDENT PSEUDOTHROMBOCYTOPENIA

LI Bo1，SHI Min2*，SONG Jun2，GAO Yugao2，WANG Yan2
（1.Department of Health Examination，Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To analyze the clinical information and laboratory examinations in patients with ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia（EDTA-PTCP）and to explore its mechanism.MethodsThe results of platelet count between instrumental and manual method were compared；The platelet morphology in blood smears of EDTA-anticoagulant and nonanticoagulant was examined using Wright-Giemsa staining.IgG，IgA and IgM immunoglobulin antibodies were detected using indirect immunofluorescence method.Results①The incidence rate of EDTAPTCP was 1.17%and EDTA-PTCP mostly occured in older people regardless of gender，the incidence rate of EDTA-PTCP patients with cardiovascular disease was higher.②The platelet count of EDTA-K2anticoagulated blood using blood cytoanalyzer method was significantly lower than that of the manual method.③The platelet morphology in blood smears of EDTA-anticoagulant was significantly different from that in non-anticoagulant.④Patients with PTCP mostly express anti-platelet IgG or IgM antibodies.ConclusionPTCP may occur when EDTA anticoagulated blood is used and measured by blood cytoanalyzer method，which may be related to IgG or IgM autoantibodies.

R446.1

A

1007-3205（2012）09-1028-04

2012-02-02；

2012-04-25

李波（1971-），男，河北晋州人，河北省石家庄市疾病预防控制中心副主任检验师，医学学士，从事医学检验研究。

*通讯作者。E-mail：sm8344@hotmail.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.014