过量表达鲁氏酵母耐盐基因GPD1对酿酒酵母的影响

侯丽华，于雁飞，王 川，王春玲

(食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)又称 S酵母，主要应用于酱油的高盐稀态发酵过程中，用以改善酱油的风味[1-2]．S酵母是与模式生物酿酒酵母相近的半子囊菌酵母．鲁氏酵母可在高盐的环境中生长，比如，在酱油高盐稀态发酵工艺的后期盐水发酵中含盐量高达17%，鲁氏酵母依然能够生长及发酵[3].但是在此环境中包括酿酒酵母在内的大多数酵母都不能生长．

目前，一些关于鲁氏酵母的耐盐、耐渗的基因，如 ZrPMA1、ZrSOD2、ZrSOD22、ZrGPD1、ZrHOG1和 ZrHOG2等已经被克隆和测序[4-6]．其中，GPD1即 3–磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)的编码基因，其编码的酶可使磷酸二羟丙酮生成 3–磷酸甘油，从而增加甘油含量，在酵母耐盐的渗透调节中发挥举足轻重的作用[7]．因此，本文对鲁氏酵母的耐盐基因 GPD1进行研究，使其在模式酵母即酿酒酵母实验室菌株W303中过量表达，研究其对酿酒酵母耐盐性、甘油产量等的影响，为构建耐盐菌株奠定理论基础，为阐述酵母菌株的耐盐机制提供更多的理论依据．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和培养基

鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、酿酒酵母W303(Saccharomyces cerevisiae W303，MATa，leu2-3/112，ura3-1，trp1-1，his3-11/15，ade2-1，can1-100，GAL，SUC2，mal 0)、多拷贝酵母(S. cerevisiae)与大肠杆菌(E. coli)的穿梭质粒 YEplac195(Ampr，URA3)，为本实验室保存．

YPD 培养基(g/L)：酵母浸粉 10，葡萄糖 20，蛋白胨 20，121,℃灭菌 20,min．其中，40%葡萄糖溶液115,℃灭菌20,min后，加入培养基中使含量达到2%．

CM-ura培养基(g/L)：无氨基酸的酵母氮源(YNB)6.7，腺嘌呤0.05，组氨酸0.1，色氨酸0.1，亮氨酸0.1，精氨酸0.02，天冬氨酸0.1，谷氨酸0.1，异亮氨酸0.03，赖氨酸0.03，甲硫氨酸0.02，苯丙氨酸0.05，丝氨酸0.15，苏氨酸0.15，酪氨酸0.03，缬氨酸0.15，调节pH为6.5，加入1.5%的琼脂，121,℃灭菌 15,min．

1.1.2 试剂与仪器

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，北京鼎国生物技术有限公司；琼脂糖，Gene Tech(上海)有限公司；Easy Pfu DNA Polymerase、Easy Pfu 10×buffer、Ligase 10×Buffer、T4,DNA Ligase，加拿大 Fermentas生物技术公司；2.5,mmol/L dNTPs，北京全式金生物技术公司；HindⅢ内切酶、10×M Buffer、SphI 内切酶、10×H Buffer，日本东洋坊公司；腺嘌呤、组氨酸、色氨酸、亮氨酸等 15种氨基酸、无氨基酸的酵母氮源(YNB)，BBI公司．

电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂；飞鸽牌微量离心机，上海安亭科学仪器厂；My CyclerTM PCR 仪、DYY–6C 型水平电泳仪、凝胶成像仪，美国 Bio-Rad公司；紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司．

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据鲁氏酵母基因数据(http：//www.genolevures.org/zyro.html，序号为 ZYRO0A055390g)设计引物，GDP1-up：5′-GCGCATGCGTTGTTGTTGTC ATCACTC-3'(SphI) ；GDP1-dn ：5′-GCAAGCTTTT GTCTTTCTAATACAC-3′(HindⅢ)．GPD1 目的片段上游引物 5′端引入 SphI酶切位点(GCATGC)，下游引物 5′端引入 HindⅢ酶切位点(AAGCTT)．引物由上海生工公司合成．

1.2.2 构建质粒

提取鲁氏酵母基因组，并以其为模板，以 GDP1-up和 GDP1-dn为引物作 PCR扩增(95,℃模板预变性 3,min；95,℃模板变性，55、58、60,℃引物退火1.5,min，72,℃引物延伸 2,min，共 30个循环；最后72,℃再延伸 10,min)．纯化 PCR产物，并用 SphI和HindⅢ双酶切，将酶切产物连入到同样双酶切的YEplac195中，得到重组质粒YEplac195-GPD1．

1.2.3 耐盐性变化实验

分别取 200,mL灭菌后含盐量为 0、9%、18%的YPD 培养基各 3瓶，其中分别接种 106,mL–1的菌种2,mL．将上述样品置于摇床中 180,r/min、30,℃培养，每隔4,h取样测A600的值．

1.2.4 抗性实验

将待测菌株接种到 YPD液体培养基中培养(30,℃，12,h，转速＜200,r/min)；测 A600值，计算细胞浓度，取出约含5×106个细胞的菌液加入到1,mL新鲜培养液中活化 2,h；测 A600值，计算细胞浓度，取出约含2×106个细胞的菌液，10,000,r/min离心1,min，弃上清液；加入20,µL无菌水混匀，终浓度为1×106,µL-1．取 2,µL 加入到 18,µL 无菌水中稀释 10倍．同样方法按浓度递增顺序分别得到1×106、1×105、1×104、1×103、1×102,µL-1的菌液．每个稀释度取 3,µL菌液滴在所需平板上，超净台晾干后，30,℃倒置培养．

1.2.5 甘油产量的测定

Cu(OH)2悬浊液的配制：取 5支试管．各注入1,mL 0.05,g/mL 的 CuSO4溶液和 3.5,mL 0.05,g/mL的NaOH溶液，振荡，生成Cu(OH)2悬浊液．

甘油铜溶液的配制：向上述 Cu(OH)2悬浊液的试管中分别注入 6‰、7‰、8‰、9‰、10‰的甘油标准品溶液 0.5,mL，充分振荡，即生成甘油铜溶液，离心分离，取上清液备用；以超纯水为空白，630,nm 为测定波长．以 Cu(OH)2为横坐标，630,nm 下的吸光度为纵坐标绘制标准曲线．样品如上操作，将测得的值代入公式计算即可得出甘油产量[8]．

2 结果与讨论

2.1 工程菌株的构建

将构建的质粒 YEplac195-GPD1(见图 1)转入大肠杆菌感受态细胞(TOP10)中，提取质粒后，用 SphI与 HindⅢ双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测(见图2)．然后将质粒 YEplac195-GPD1和空质粒 YEplac 195分别转入酿酒酵母实验室菌株W303中[9]，得到工程菌株WYS和对照菌株WY．

图1 质粒YEplac195-GPD1结构示意图Fig.1 Schematic view of the plasmid YEplac195-GPD1

图2 重组表达质粒的SphI 和HindⅢ双酶切鉴定Fig.2 Analysis of recombined plasmid digested by SphI and HindⅢ

2.2 耐盐性变化

对工程菌株 WYS和对照菌株 WY在含盐量为0、9%、18%的 YPD 培养基中的生长情况进行研究，实验结果如图3所示．

因为在一定浓度下，酵母细胞在 600,nm下的吸光度与细胞个数有对应关系，所以本文中通过测定不同菌株在600,nm波长下的吸光度来反映菌株的生长状况．由图 3可知，随着盐的加入，菌株 WYS和对照菌株 WY到达对数期的时间变长．这说明盐的加入，使得细胞内外渗透压发生变化，从而影响细胞增殖，导致到达对数期的时间延长且延缓对数期细胞的增殖．但是，在每个含盐量下，WYS与对照菌株 WY相比，对细胞的抗渗透压耐盐作用仍旧可以明显表现出来．

由上述分析可知，重组后的质粒 YEplac195-GPD1明显比空质粒 YEplac195促进了酵母细胞的生长，不仅表现在对数生长期的提前，而且平稳期的细胞数量也有所增加，这说明基因 GPD1对于酵母细胞耐盐性的重要作用．

图3 菌株在不同含盐量YPD培养基中的生长情况Fig.3 Growth of engineered strains in YPD culture media with different salt concentration

2.3 抗性变化

分别研究菌株 WYS和 WY 对 LiCl、盐、山梨醇、乙醇和高温的抗性，结果如图 4所示，从左到右菌体的浓度依此为 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102,µL-1．

由图 4可见，在 LiCl、NaCl、乙醇不同程度刺激而产生的渗透压力下[2]，WYS生长趋势明显优于WY，表现出了较好的耐性；对比图 4(a)和图 4(e)发现，(a)组菌落比(e)组菌落大而圆，这说明随着盐的加入，导致了细胞内水分的外流，细胞发生了质壁分离现象．而1,mol/L的山梨醇浓度对于该系列菌株来说并无太大影响．42,℃培养对两株菌株的影响基本相同，只有最高浓度才能生长，但是 WYS的生长优于WY，表明过量表达GPD1对细胞耐受热具有明显的作用．

图4 工程菌株的抗性比较Fig.4 Tolerance comparison of engineered strains

2.4 甘油产量变化

按照 1.2.5方法得到标准曲线 y＝0.044,3x＋0.001,3，R2＝0.999,6．将工程菌株WYS和WY 分别培养在含盐量为0、9%、18%的YPD培养基中，30,℃培养．当培养至对数后期，测定细胞内外甘油产量，如图5所示．

图5 甘油产量变化Fig.5 Changes of glycerol content

由图 5可知，随着含盐量的增加，WYS和 WY菌株的甘油产量都依次增加，但增加的程度并不一致，这表明它们对环境的应答并不完全一样．对于同一菌株，随着含盐量的增加，其甘油产量也随之增加；对于同一个含盐量，WYS菌株的甘油产量高于WY，结合图 4(e)结果，这说明 WYS中过量表达GPD1使其更能适应外界渗透压的变化．

3 结 语

基因 GPD1只是耐盐通路中的一个小分支，要进一步阐明酵母菌株的耐盐机制，将需要研究此通路中的其他关键基因，如FPS1(编码甘油由胞内向胞外渗透的通道蛋白)、PMA1(编码质膜 H+-ATPase)、PDC1(编码丙酮酸脱羧酶)、ALD6(编码胞质乙醛脱氢酶)等．还需建立起一个立足点较多的基因功能网络，结合酵母的代谢网络，对酱油添加酵母的耐盐机制进行研究．此外，在本研究中只是对过量表达鲁氏酵母耐盐基因 GPD1对酿酒酵母 W303的影响进行了分析，并没有研究自身过表达 GPD1对耐盐家族成员鲁氏酵母的影响．因此在后续的研究中可以利用质粒 pZEU[10]在鲁氏酵母△ura3缺陷型菌株中过量表达耐盐基因GPD1．

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