提高蛹虫草质量和产量的综合生产技术研究

杨强 刘金龙 郑小江 陈瑶

摘要：目前市场上生产的蛹虫草产品没有统一的质量标准，影响市场对蛹虫草产品的消费，研究结果表明，蛹虫草菌种Ｈｚ１孢子复壮的菌株培养的子实体干重高于菌种Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１孢子复壮的菌株培养的子实体干重，其液体培养基最优组合为葡萄糖2０ ｇ／Ｌ、蛋白胨8 ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。生产富硒蛹虫草培养基的最优主料为富硒大米４５ ｇ、培养液５５ ｍＬ，在培养温度为２２ ℃、空气相对湿度70％时蛹虫草子实体生长最好。综合而言，子实体培养最优条件为日间温度２2 ℃、夜间温度１５ ℃、空气相对湿度７０％、光照度２００ ｌｘ，并结合先用日光灯照射、待子实体长至１～２ ｃｍ时使用蓝紫灯照射处理的产量最高。检测结果显示，蛹虫草子实体的有效成分含量分别为硒５２．０３ ｍｇ／ｋｇ、蛋白质２７．７４％、腺苷０．０５％、多糖２．５０％、虫草素２．６１％、氨基酸２６．９２％，尤其是所含的虫草素具有工业提取价值。

关键词：蛹虫草；质量；产量；技术参数；优化；生产技术

中图分类号：Ｓ５６７．３＋５；Ｑ９３－３；Ｑ９３９．９文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）18－4069-07

Integrated Production Technology for Improving the Quality and Yield of

Cordyceps militaris

ＹＡＮＧ Ｑａｎｇ，ＬＩＵ Ｊｉｎ－ｌｏｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｙａｏ

(School of Biological Science and Technology/Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, Hubei, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅｒｅ ｈａｓ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ａｎｙ ｕｎｉｆｏｒｍ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ（Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ ｉｎ ｍａｒｋｅｔ， ｗｈｉｃｈ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｃｏｎｓｕｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｏｄｓ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｒｕｉｔ ｂｏｄｙ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ Ｈｚ１ ｓｐｏｒｅ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｂ１， Ｂｚ１， Ｈ１ ｓｐｏｒｅ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ 2０ ｇ／Ｌ， ｐｅｐｔｏｎｅ 8 ｇ／Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍａｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｃ． ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｗａｓ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｏｒｎ ４５ ｇ ＋ ｍｅｄｉｕｍ ５５ ｍＬ． Ｔｈｅ ｆａｓｔｅｓｔ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ２２ ℃， ａｎｄ 70％ ｈｕｍｉｄｉｔｙ． Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ２2 ℃ ａｔ ｄａｙｔｉｍｅ ａｎｄ １５ ℃ ａｔ ｎｉｇｈｔ， ｈｕｍｉｄｉｔｙ ７０％， illuminance ２００ ｌｘ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｂｌｕｅ－ｖｉｏｌｅｔ ｒａｙｓ ｗｈｅｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｗａｓ １～２ ｃｍ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ， ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｗａｓ ５２．０３ ｍｇ／ｋｇ， ２７．７４％， ０．０５％， ２．５０％， ２．６１％ ａｎｄ ２６．９２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｖａｌｕｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ； ｑｕａｌｉｔｙ； ｙｉｅｌｄ； ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ； ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

蛹虫草［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ］又称为北冬虫夏草，属真菌界的子囊菌门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）肉座菌目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）麦角菌科（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）虫草属［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（Ｆｒ．）Ｌｉｎｋ］ 真菌，与冬虫夏草［Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ （Ｂｅｒｋ．） Ｓａｃｃ．］为同属异种真菌［１］，是虫草属的模式种；在我国的吉林、四川、河北、湖南、湖北、山西等省均有生长，美国、加拿大、意大利、日本、德国、俄罗斯等国也有分布，但在自然界的分布与产量远比冬虫夏草稀少。蛹虫草药性作用温和，长期以来就是既可药用又可食用的高级滋补品，并且一年四季皆可服用，对老、少、病、弱、虚者皆宜，无任何副作用［2］，市场潜力巨大。但由于野生蛹虫草数量极少，不能满足市场的需求，即使价格昂贵也供不应求，所以人们采用科学方法对其进行了人工培植［3－６］，也取得了成功。但人工培养的蛹虫草尤其是富硒蛹虫草，其药用成分的含量高低不一，这对蛹虫草的药性发挥、滋补功效稳定性、市场信誉产生了不良影响，反映出生产企业不仅没有形成蛹虫草人工生产质量化标准，而且无统一规范化的生产工艺流程［７－１０］。针对蛹虫草生产工艺流程中影响产品质量和产量的主要问题，我们开展了系统研究，初步建立了蛹虫草高产优质工业化生产技术流程，现将结果报告如下。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌种参试的蛹虫草菌种有４个，分别是Ｂ１（购于中国科学院微生物研究所），Ｈ１（购于华中农业大学微生物研究所），Ｂｚ１（购于湖北民族学院微生物实验室），Ｈｚ１（购于恩施职业技术学院微生物实验室）。菌种回来后都进行了孢子复壮［11］，成为各自的系列菌种。天然冬虫夏草子实体购自当地的同仁堂药店。

１．１．２培养基及培养主料原料基础培养基为ＰＤＡ培养基（不含琼脂），试验原料有葡萄糖、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＳｅＯ３（以上为化学纯）和维生素Ｂ１（ＶＢ１，医用）、天然硒浓缩水（生物资源保护与利用湖北省重点实验室配制）；生长培养的主料原料为从当地市场购买的恩施出产的含硒２．７ ｍｇ／ｋｇ的大米（恩施清水桥米）以及马铃薯、燕麦、荞麦、稻谷，此外还有珍珠岩。

１．１．３仪器参试的仪器为生物资源保护与利用湖北省重点实验室原已置备的ＬＲＨ－ＺＳＯ恒温培养箱、ＤＸ－Ⅱ磁力搅拌器、ＢＴ２５Ｓ电子天平、８０－２离心机、ＰＨＳ－２５ ｐＨ计、ＬＣ－１０ ＡＴｕｐｐｌｕｓ液相色谱仪、示差析光检测器、紫外检测器、ＹＸＱＳＧ４６２８０手提式压力蒸汽灭菌器、ＩＯＰ－Ⅲ无菌操作台、格力ＫＦＲ－ＳＮ５空调、ＷＳ２０２０Ａ２温湿度仪、烘箱、ＧＸＭＱ系列灭菌器、ＣＯ２探测仪、安捷伦HP1100氨基酸自动分析仪、鼓风机、接种仪器、移液枪、改装电动穿孔装置、改装注水枪、酒精灯等，以及三角瓶、广口玻璃瓶、聚乙烯封口塑料薄膜、耐高温橡皮筋等耗材。

１．２方法

１．２．１碳源对培养基优化的试验设计基础培养基（液体）ＰＤＡ配制：取２００ ｇ马铃薯去皮切成薄片，加水１ ０００ ｍＬ煮沸３０ ｍｉｎ，用纱布过滤，取上清液，加入葡萄糖２０ ｇ、蛋白胨１０ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ、维生素Ｂ１微量［12］。将基础培养基（液体）ＰＤＡ中的２０ ｇ葡萄糖成分分别换成２０ ｇ麦芽糖、１５ ｇ蔗糖、２０ ｇ可溶性淀粉，配制成３种新碳源液体培养基，加上基础培养基（液体）ＰＤＡ，一共是４种碳源液体培养基。取500 ｍＬ三角瓶若干个，每个三角瓶分别装入２５０ ｍＬ 的４种碳源液体培养基，用封口膜封口灭菌，分别接种蛹虫草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４个菌种，接种量都为２５ ｍＬ，各菌种不同碳源培养基的处理都接５瓶，在２２ ℃、磁力搅拌器转速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、避光培养条件下培养７２ ｈ，观察各菌种在不同碳源培养基里的生长情况。７２ ｈ后过滤菌丝体，用去离子水洗涤５次，置烘箱中６０ ℃烘到恒重，冷却后测定各菌种菌丝体干重［3］。

１．２．２氮源对培养基优化的试验设计将基础培养基（液体）ＰＤＡ中的１０ ｇ蛋白胨成分分别换成５ ｇ酵母粉、５０ ｇ麦麸、３０ ｇ尿素、２０ ｇ黄豆粉，配制成４种新氮源液体培养基，加上基础培养基（液体）ＰＤＡ，一共是５种氮源液体培养基。同样用500 ｍＬ三角瓶分别装入２５０ ｍＬ 的５种氮源液体培养基，封口膜封口灭菌后分别接种蛹虫草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４个菌种，接种量也是２５ ｍＬ，各菌种不同氮源培养基的处理都接５瓶，在２２ ℃、磁力搅拌器转速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、避光培养条件下培养７２ ｈ，观察各菌种在不同氮源培养基里的生长情况。培养结束后过滤菌丝体，用去离子水洗涤５次，置烘箱中６０ ℃烘到恒重，冷却后测定各菌种菌丝体干重［３］。

１．２．３液体培养基优化Ｌ９（３４）正交试验设计以基础培养基中的葡萄糖、蛋白胨、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４作为４个因素，各因素均取３个水平，其他成分不变，设计了一个Ｌ９（３４）正交试验［13］，蛹虫草菌种为Ｈｚ１，详情见表１。试验接种量为２５ ｍＬ，在磁力搅拌器转速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、２２ ℃条件下培养７２ ｈ，观察Ｈｚ１菌丝生长情况，测定菌丝体干重，方式同上。

１．２．４最优培养主料比较试验菌种生长培养基分别有大米培养基、燕麦培养基、荞麦培养基、萌发稻谷培养基、萌发荞麦培养基、珍珠岩+米粉混合物培养基，各生长培养基主料的用量都为４５ ｇ，只是珍珠岩+米粉混合物培养基中的珍珠岩用量分别有３个，具体见表２。所有生长培养基都分别加入１．２．３得到的最佳液体培养液组合４５、５５、６５ ｍＬ；使用的蛹虫草菌种为Ｈｚ１，接种量２５ ｍＬ，自然光照，温度２２ ℃，培养５０ ｄ后测定所得子实体的干重［14］。

１．２．５蛹虫草孢子复壮培养用灭菌手术解剖刀分别在蛹虫草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４个菌种成熟的孢子部位划一切口，取灭菌短镊子轻轻地碰击数次，用装有培养基的培养皿（平皿）接住，使蛹虫草孢子接种于培养皿内的培养基中，移至恒温培养箱中２２ ℃复壮［15］培养２４ ｈ，观察其菌落特征。随后将以上一级菌种接种到最优液体培养基中培养７２ ｈ，培养条件为２２ ℃、，磁力搅拌器转速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ。将二级菌种接种到最优人工栽培培养基中，每组平行５０瓶，记录转色时间、子实体形态、子实体干重。

１．２．６培养基灌装程序中灭菌控制设计及接种器具比较提前１ ｄ将生产所需数量的广口玻璃瓶（８００ ｍＬ）进行二次清洗，分装排列整齐。由制种室提供液体培养基所需的配料量，由灌装室进行配料操作，每批生产３ ０２４瓶。灭菌流程为灭菌温度１００ ℃、灭菌方式有高压灭菌（３０、４５ ｍｉｎ）和间歇灭菌（３０ ｍｉｎ＋３０ ｍｉｎ）；灭菌完成后进行蛹虫草接种。接种室在紫外灭菌１ ｈ后再等待５ ｍｉｎ才能进入接种室；接种前工作人员要用７５％的乙醇喷洒工作服，用脱脂棉蘸取７５％的乙醇擦拭双手，并检测所有待装瓶，观察有无破痕、薄膜有无脱落等状况［１６，１７］，及时处理分装并标记、记录。随后用移液枪、改装后的接种器分别进行接种，接种量１０％，接种速率有１０瓶／ｍｉｎ、２０瓶／ｍｉｎ；菌种选用Ｈｚ１，观察记录菌丝、子实体生长状态，最后统计Ｈｚ１菌种子实体的系统污染率。

１．２．７温度、空气相对湿度对蛹虫草４个菌种子实体培养管理参数研究设计对温度、空气相对湿度、蛹虫草菌种进行单因素试验［18］，温度设置１５、１８、２０、２２、２４ ℃ ５个水平；空气相对湿度设置６０％、６５％、７０％、７５％、８０％ ５个水平；４个蛹虫草菌种为Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１。从单因素试验结果中各筛选出２个最优的水平进行３因素的Ｌ４（２３）正交试验（表３），以筛选最适合蛹虫草子实体生长的培养条件［19］。

１．２．８温度、空气相对湿度、光照度影响蛹虫草Ｈｚ１菌种的子实体产量正交设计选取白天温度、夜间温度、空气相对湿度、光照度４个因素，设置３水平的Ｌ９（３４）正交试验，因素与水平组合情况见表４，以筛选最适合蛹虫草子实体生长的培养条件。

１．２．９不同光源对蛹虫草Ｈｚ１菌种子实体生长及产量的影响选取3５０瓶接种了蛹虫草Ｈｚ１菌种的装瓶，分别进行不同光源的处理： ①日光灯单独照射；②红灯单独照射；③蓝紫灯单独照射；④先用红灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用蓝紫灯照射；⑤先用蓝紫灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用红灯照射；⑥先用日光灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用蓝紫灯照射；⑦先用日光灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用红灯照射。每处理50瓶，处理后分别进行子实体生长描述，并测定子实体干重［20］。

１．２．１０蛹虫草Ｈｚ１菌种和天然冬虫夏草子实体成分检测蛹虫草Ｈｚ１菌种和天然冬虫夏草子实体的硒含量及矿质营养元素含量采用原子吸收法检测［9］；氨基酸种类和含量采用安捷伦ＨＰ１１００氨基酸自动分析仪测定［11］；腺苷含量采用ＡＴＰ法检测［5］；多糖含量采用硫酸苯酚法检测［21］。虫草素含量采用高效液相色谱仪、示差折光检测器与紫外检测器串联的方法测定［5］。

２结果与分析

２．１蛹虫草各菌种在不同碳源优化培养基里的菌丝体生长情况

蛹虫草各菌种在不同碳源优化培养基里的菌丝体生长情况见表５。从表５可见，Ｂ１菌种生长最适的碳源为２０ ｇ／Ｌ葡萄糖，Ｂｚ１菌种生长最适的碳源为１５ ｇ／Ｌ蔗糖，Ｈ１菌种生长最适的碳源为２０ ｇ／Ｌ葡萄糖，Ｈｚ１菌种生长最适的碳源为２０ ｇ／Ｌ葡萄糖。４个菌种中，Ｈｚ１菌种的最高菌丝生长量最大，依次比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１最高菌丝生长量高出了4．5％、２０．９％、３２.0％。

２．２蛹虫草各菌种在不同氮源优化培养基里的菌丝体生长情况

蛹虫草各菌种在不同氮源优化培养基里的菌丝体生长情况见表６。从表６可见，Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１菌种生长最适的氮源均为１０ ｇ／Ｌ蛋白胨。４个菌种中Ｈｚ１菌种的菌丝生长量最大，依次比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１菌种的最高菌丝生长量高出了６．１％、２２．５％、３０．８％。

２．３蛹虫草菌种Ｈｚ１液体培养基优化Ｌ９（３４）正交设计试验结果

蛹虫草菌种Ｈｚ１液体培养基优化Ｌ９（３４）正交试验结果见表７。从表７可见，在４个试验因素中，影响菌丝量高低的顺序为：Ａ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｃ；最优组合为Ａ2Ｂ1Ｃ２Ｄ２。即葡萄糖2０ ｇ／Ｌ，蛋白胨8 ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ 1.0 ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。

２．４蛹虫草菌种Ｈｚ１子实体培养基最优主料与培养液比较

６个生长培养基主料对蛹虫草菌种Ｈｚ１子实体产量的影响结果见图１。从图１可见，生长培养基主料为大米４５ ｇ、培养液为５５ ｍＬ时，蛹虫草子实体产量最高，达到了５．３２ ｇ／瓶，并表现出培养液偏少时其减产不明显、但培养液偏多时减产显著的现象，稳产性算是最好的；生长培养基主料为燕麦４５ ｇ、培养液为５５ ｍＬ时，蛹虫草子实体产量为５．２６ ｇ／瓶，但培养液减少、增多都严重减产，稳产性差；生长培养基主料为荞麦４５ ｇ、培养液为６５ ｍＬ时，蛹虫草子实体产量并列最高，达到５．３２ ｇ／瓶，但随着培养液减少出现大幅度减产；生长培养基主料为萌发荞麦４５ ｇ、培养液为4５ ｍＬ时，蛹虫草子实体产量为２．５０ ｇ／瓶，产量太低，无应用价值；生长培养基主料为萌发稻谷４５ ｇ、培养液为５５ ｍＬ时，蛹虫草子实体产量为４．００ ｇ／瓶，也无应用价值；生长培养基主料为珍珠岩+米粉混合物４５ｇ、培养液为４５ｍＬ时，蛹虫草子实体产量仅为１．０２ ｇ／瓶，在６个生长培养基主料中产量最低。

２．５４个蛹虫草菌种孢子复壮培养结果

蛹虫草４个菌种Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１成熟的孢子复壮培养结果见表８。从表８可见，用Ｈｚ１菌种孢子复壮培养得到的子实体不仅外形好看，而且每瓶产量比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１菌种孢子复壮培养得到的子实体产量依次高３．２％、２３．８％、９４．０％。反映出Ｈｚ１是４个蛹虫草菌种子实体产量表现最好的菌种。

２．６Ｈｚ１菌种培养基灌装程序中灭菌效果

蛹虫草Ｈｚ１菌种培养基灌装程序中灭菌控制比较结果见表９。从表９可见，１００ ℃灭菌３０ ｍｉｎ后冷却、然后再用１００ ℃灭菌３０ ｍｉｎ的间歇灭菌方式效果最好，系统污染率仅为０．０８％；其次是１００ ℃灭菌４５ ｍｉｎ的高压灭菌方式，系统污染率为０．１０％；而１００ ℃灭菌３０ ｍｉｎ的高压灭菌方式系统污染率最高，达到了０．２０％。

２．７不同接种器具对Ｈｚ１蛹虫草菌丝和子实体生长的影响

移液枪、改装后的接种器对Ｈｚ１菌种子实体生长的影响结果见表１０。从表１０可见，改装的接种器接种后，Ｈｚ１菌种的菌丝生长分布均匀，子实体形态美观，整体品质较好；而移液枪接种后Ｈｚ１菌种的菌丝生长分布不均匀，子实体形态不一致，整体品质较差。改装的接种器接种速度可达２０瓶／ｍｉｎ，比常规接种速度提高１倍，而且不增加系统污染率。

２．８温度、空气相对湿度对４个菌种子实体生长的影响

温度对４个菌种子实体干重均值的影响结果见图２。从图２可见，培养温度在２２ ℃时，４个菌种子实体干重的均值最大。空气相对湿度对４个菌种子实体干重均值的影响结果见图３。从图３可见，空气相对湿度在７０％时，４个菌种子实体干重的均值最大。在４个菌种子实体干重方面，Ｈｚ１菌种子实体的干重最重，为４．８８ ｇ／瓶；Ｂｚ１菌种子实体的干重次之，为４．５０ ｇ／瓶；Ｂ１菌种子实体的干重为３．４２ ｇ／瓶；Ｈ１菌种子实体的干重为３．３２ ｇ／瓶。适合蛹虫草子实体生长的Ｌ４（２３）正交试验培养结果见表１１。从表１１可见，影响蛹虫草子实体产量高低的因素排序为Ｃ＞Ａ＞Ｂ，最佳组合为Ａ２Ｂ2Ｃ２，即温度为２２ ℃、空气相对湿度为70％、菌种选取Ｈｚ１时，子实体平均干重最重。

２．９温度、空气相对湿度、光照度影响Ｈｚ１菌种的子实体产量Ｌ９（３４）正交设计试验结果

蛹虫草菌种Ｈｚ１的子实体培养条件Ｌ９（３４）正交试验结果见表１２。从表１２可见，影响蛹虫草子实体产量高低的因素排序为为Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，最佳组合为Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２，即蛹虫草Ｈｚ１菌种子实体最优培养条件为白天温度２２ ℃、夜间温度１５ ℃、空气相对湿度７０％、光照度２００ ｌｘ。

２．１０不同光源处理对蛹虫草Ｈｚ１菌种子实体生长的影响

不同光源对Ｈｚ１菌种子实体产量的影响结果表明，处理⑥（先用日光灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用蓝紫灯照射）的蛹虫草子实体产量为５．３０ ｇ／瓶；处理⑦（先用日光灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用红灯照射）的蛹虫草子实体产量为５．２８ ｇ／瓶；处理⑤（先用蓝紫灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用红灯照射）的蛹虫草子实体产量为５．２２ ｇ／瓶；处理④（先用红灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用蓝紫灯照射）的蛹虫草子实体产量为５．０４ ｇ／瓶；而处理③（蓝紫灯单独照射）的蛹虫草子实体产量为４．７６ ｇ／瓶；处理②（红灯单独照射）的蛹虫草子实体产量为４．４８ ｇ／瓶；处理①（日光灯单独照射）的蛹虫草子实体产量仅为３．２６ ｇ／瓶。说明先用日光灯照射，待子实体长至１～２ ｃｍ时使用蓝紫灯照射处理的子实体产量最高，效果最好。

２．１１蛹虫草Ｈｚ１菌种和冬虫夏草子实体的氨基酸含量比较结果

蛹虫草Ｈｚ１菌种和天然冬虫夏草子实体在氨基酸含量方面的测定结果见表１３。从表１３可见，在人体必需氨基酸（赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）含量［22，23］方面，蛹虫草Ｈｚ１菌种除赖氨酸、色氨酸含量分别比天然冬虫夏草的低１８．２%、３．３%之外，苯丙氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸的含量依次比天然冬虫夏草的提高１２９．５％、１２０．９％、７３．３％、４３．８％、３８．４％、１１．１％。在人体半必需氨基酸（精氨酸、组氨酸）含量方面，蛹虫草Ｈｚ１子实体的精氨酸、组氨酸含量分别比天然冬虫夏草的低２８．７%、２０．０%。不过在总氨基酸含量［22］方面，蛹虫草的总氨基酸含量比天然冬虫夏草的总氨基酸含量高２４．８％，说明蛹虫草的营养成分不亚于天然冬虫夏草的。

２．１２蛹虫草Ｈｚ１菌种和冬虫夏草子实体的矿质营养元素比较结果

蛹虫草Ｈｚ１菌种和天然冬虫夏草子实体在矿质营养元素含量方面的测定结果见表１４。从表１４可见，蛹虫草微量元素含量与天然冬虫夏草相比，Ｓｅ含量提高了８６８．９％，Ｍｎ含量提高了５３．３％；但Ｎｉ含量降低了７０．４%，Ｃｕ含量降低了５９．１%，Ｚｎ含量降低了６５．８%，Ｆｅ含量降低了６１．２%。蛹虫草大量元素含量与天然冬虫夏草相比，Ｋ含量提高了４１４．７％，但Ｃａ含量降低了６０．３%。检测结果显示，本研究培养的蛹虫草属于富硒类型，这对于功能性食品的开发具有重要价值［24，25］；并且Ｃｕ是重金属，Ｃｕ含量降低有利于人体健康［26］；而Ｎｉ是对健康有益的微量元素［27］，Ｎｉ偏低，说明将其进一步提高到天然冬虫夏草含量的水平还需要做许多工作。

２．１３蛹虫草Ｈｚ１菌种其他成分含量

蛹虫草Ｈｚ１菌种子实体其他成分含量测定结果为蛋白质２７．７４％、多糖２．５０％、腺苷０．０５％、虫草素２．６１％，。而天然冬虫夏草的虫草素含量为０．０１％，远远低于本研究培养的蛹虫草Ｈｚ１菌种子实体的虫草素含量。

３小结与讨论

试验对蛹虫草生产工艺流程中影响产品质量和产量的主要问题进行了探讨，初步建立了蛹虫草高产优质工业化生产技术流程。结果显示，蛹虫草菌种Ｈｚ１孢子复壮的菌株培养的子实体干重高于菌种Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１孢子复壮的菌株培养的子实体干重，液体培养基最优组合为葡萄糖2０ ｇ／Ｌ、蛋白胨8 ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。生产富硒蛹虫草培养基的最优主料为富硒大米４５ ｇ、培养液５５ ｍＬ；在菌种培养环境为最适温度２２ ℃、空气相对湿度70％时，蛹虫草菌种Ｈｚ１的子实体平均干重最大。综合而言，子实体培养最优条件为日间温度２2 ℃、夜间温度１５ ℃、空气相对湿度７０％、光照度２００ ｌｘ，并结合先用日光灯照射、待子实体长至１～２ ｃｍ时使用蓝紫灯照射处理的产量最高。检测结果显示，用本研究技术生产出来的蛹虫草子实体的有效营养成分含量分别为硒５２．０３ ｍｇ／ｋｇ、蛋白质２７．７４％、氨基酸２６．９２％、腺苷０．０５％、多糖２．５０％、虫草素２．６１％。这些参数对优化蛹虫草生产工艺和建立产品质量检测体系具有重要参考价值。而且主要有效成分和营养成分要高于天然冬虫夏草，尤其是所含的虫草素具有工业提取价值［28］，证明应用本研究技术生产出来的蛹虫草产量高、质量好，具有推广应用价值。但在蛹虫草的腺苷、赖氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸以及Ｎｉ含量上有待进一步研究提高。

参考文献：

［１］ 韦会平，肖波，胡开治．蛹虫草药用价值考［Ｊ］．中药材，２００４，２７（３）：２１５－２１７．

［2］ 柴建萍，白兴荣，谢道燕．蛹虫草主要有效成分及其药理功效［Ｊ］．云南农业科学，２００３（４）：２２－２３．

［3］ 谢雪钦．蛹虫草液体产孢条件优化及其侵染过程的初步研究［Ｄ］．福州：福建农林大学，２００７．

［4］ 李颜，史薇娜，唐庆九，等．比色法测定冬虫夏草和蛹虫草中多糖和甘露醇的含量［Ｊ］．食用菌学报，２００７，１４（３）：５３－５７．

［５］ 黄兰芳，郭方遒，梁逸曾，等．ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量［Ｊ］．中国中药杂志，２００４，２９（８）：７６２－７６４．

［６］ 姚国洪，刘喜屏，刘广红，等．蛹虫草菌丝生长研究［Ｊ］．微生物学杂志，２００３，２３（１）：６１－６２．

［７］ 张显科，王玉柱，刘文霞．蛹虫草与冬虫夏草化学成分比较［Ｊ］．辽宁大学学报（自然科学版），１９９６，２３（４）：７９－８２．

［８］ 宋金俤，刘超．蛹虫草产业化栽培瓶颈及其对策［Ｊ］．中国食用菌，２００９，２８（１）：６２－６４．

［９］ 张弛．富硒虫草中硒的赋存形态及分布特点［Ｊ］．食品科学，２００９， ３０（２３）：１９３－１９５．

［１０］ 贲松彬，黄子琪，王莹，等．蛹虫草富硒条件优化及硒对其中主要活性成分的影响［Ｊ］．食品科学，２００９，３０（１７）：２６６－２６９．

［１１］ 郑婷婷，李多伟，王英娟，等．蛹虫草液体培养条件优化及有效成分含量分析［Ｊ］．菌物研究，２００４，２（４）：２２．

［１２］ 朱宏图．人工培育蛹虫草的研究［Ｊ］．中药通报，１９８７，１２（１２）： ２１．

［１３］ 柴建萍，白兴荣，谢道燕．蛹虫草菌深层发酵培养基正交实验［Ｊ］．云南农业科技，２００４（３）：２６．

［１４］ 朱雅红，桂仲争．蛹虫草液体菌种通气发酵培养及其营养成分分析［Ｊ］．食品与生物技术学报，２００９，２８（５）：６９９－７０４．

［１５］ 张显科，刘文霞．不同培养料栽培蛹虫草试验研究［Ｊ］．中国食用菌，１９９７，１６（２）：２１．

［１６］ 冉翠香，王莉，许智宏．人工培育蛹虫草子实体原基的诱发形成［Ｊ］．中国食用菌，２００１，２0（４）：９－１０．

［１７］ 汪宇，于荣敏，佟志清，等．蛹虫草液体培养条件的优化及生长动力学考察［Ｊ］．中国野生植物资源，２００３，２２（４）：５６．

［１８］ 王志高，温鲁，袁小转，等．加硒对蛹虫草主要活性成分含量的影响［Ｊ］． 安徽农业科学，２００７，３５（２９）：９２９３－９２９４．

［１９］ 李信，许雷，裴鑫德．蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）菌丝体液体培养基的优化和发酵条件的研究［Ｊ］． 核农学报，１９９８，１２（１）：３５－４０．

［２０］ 潘新法． 蛹虫草子实体的人工培育及超氧化物歧化酶的活性测定［Ｊ］． 食用菌学报，１９９５，２（３）：２５－２８．

［２１］ 车振明，王燕，周黎黎．人工蛹虫草子实体多糖分离最佳工艺研究［Ｊ］．食品研究与开发，２００４，２５（５）：７８－７９．

［２２］ 刘建华，孙月，卜宁．人工培育蛹虫草与野生蛹虫草氨基酸成分测试分析［Ｊ］．中国食用菌，１９９９，１８（３）：１８－１９

［２３］ 孙悦迎，张旭东．冬虫夏草与蛹虫草特性分析［Ｊ］．中医药学报，２００２，３０（２）：４３－４４．

［２４］ 于田田，钱和．生物富硒对蛹虫草菌丝体化学成分的影响［Ｊ］． 食品科技，２００６（１）：１３３－１３５．

［２５］ 铁梅，杨淑琴，娄虹，等．硒对蛹虫草生长发育的影响［Ｊ］． 辽宁大学学报（自然科学版），２００５，３２（１）：２５－２７．

［２６］ 周枝凤，梁逸曾，胡芸，等．均匀设计在蚕蛹虫草和冬虫夏草活性成分分析中的应用［Ｊ］．分析测试学报，２００４，２３（２）：３５－３７．

［２７］ 何淑丽，赵凤阁．十年来蛹草的成分及药理研究概述［Ｊ］．长春中医学院学报，１９９７，１３（６）：６４－６５．

［２８］ 王英娟，李多伟，王义潮，等．蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究［Ｊ］． 西北植物学报，２００５，２５（９）：１８６３－１８６７．

收稿日期：２０１１－０８－２８

基金项目：湖北民族学院高校产学研合作项目（ｃｘｙ２００９Ｂ０３７）；湖北民族学院生物科学与技术学院２０１１大学生创新项目（ＳＫＹ２０１１４９）

作者简介：杨强（１９８９－），男，湖北宜昌人，２００７级本科生，（电话）１５０７１８４６６４２（电子信箱）４１１０９３４５０＠ｑｑ．ｃｏｍ；通讯作者，刘金龙，高级实验师，

主要从事野生动植物保护与利用研究工作，（电话）１３４０２７３３８１８（电子信箱）ｌｉｕｊｌ１６１８＠１６３．ｃｏｍ。