点阵CO2激光作用小鼠皮肤光老化模型后创面愈合过程中皮肤超微结构的变化

丁卫　谭军　李高峰　欧阳华伟　秦晓东

[摘要]目的：观察点阵CO2激光作用小鼠皮肤光老化模型后创面愈合过程表皮的超微结构的变化规律。方法：将5只昆明小鼠以UVB紫外线照射，制备成皮肤光老化模型，行点阵CO2激光（Deep FX）干预，观察激光创面愈合情况，并且分别于干预前、干预后第1、3、7、15天取材，进行HE染色和电镜观察。结果：点阵CO2激光作用于小鼠皮肤光老化模型后，术后第1天，见激光损伤灶周围变性组织及细胞水肿，成纤维细胞线粒体体积增大；术后第3天见表皮细胞向创底迁移，成纤维细胞出现增生，细胞内线粒体增多，粗面内质网扩张，胶原纤维见周期性横纹；术后第7天激光损伤灶创底见表皮细胞增殖，创面基本愈合，成纤维细胞增生活跃，线粒体、粗面内质网丰富，内质网扩张明显、胶原纤维增多增粗；术后第15天，成纤维细胞趋于稳定，胶原纤维排列密集。结论：点阵CO2激光通过对表皮的线粒体、粗面内质网产生影响，达到对光老化皮肤良好疗效。

[关键词]光老化；点阵CO2激光；超微结构

[中图分类号]R730.57[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）10-0-0

光老化是人体暴露部位皮肤衰老的主要原因，随着生活水平的提高，皮肤衰老的防治已经成为人们生活的重要部分。目前点阵CO2激光治疗皮肤光老化具有良好的疗效，在临床上得到广泛的应用，点阵CO2激光作用于光老化皮肤后，皮肤修复过程中其超微结构发生的病理变化以及这些变化的意义值得研究。本研究采用UVB照射小鼠背部皮肤，制造皮肤光老化模型，点阵CO2激光干预后，取材连续电镜观察创面愈合过程中皮肤超微结构的变化规律，现报道如下。

1材料和方法

1.1 主要仪器： LKB-Ⅲ型超薄切片机（瑞士）H-7500型透视电镜（日本）。

1.2 动物模型制备及实验分组

1.2.1 动物：清洁级昆明种小白鼠5只，体重20～25g，雌雄不限。

1.2.2 小鼠皮肤光老化模型制备：剪除小鼠背部5cm×10cm区域的毛，用15W＼UVB紫外灯置于小鼠背部裸露皮肤区正上方35cm处，每天照射2h，共照射50天，每天用电动剃须刀剔除生长出的小鼠毛，观察小鼠皮肤变化，并拍照。

1.2.3 点阵激光干预：选用C02点阵激光（Deep FX，LUMENIS Ltd，美国），能量25～30 mJ，密度15%，单次扫描。创面予四环素眼膏外涂，一天3次。

1.3 观察指标

1.3.1 大体观察：每组小鼠取材时观察激光干预后皮肤创面愈合情况。创面愈合以创面封闭且完全上皮化为判定标准。

1.3.2 组织学观察：分别于干预前、干预后第1、3、7、15天取材，切取1cm×0.5cm皮肤组织标本。组织标本固定后，包埋，切片，行组织学观察。 HE染色：观察切片炎性细胞数量、胶原纤维排列、创面愈合变化情况。电镜观察： 表皮成纤维细胞内超微结构及胶原纤维的变化规律。

2结果

2.1 小鼠皮肤光老化模型的鉴定：小鼠背部皮肤照射区出现皱纹、变厚变硬、色素沉着等改变。HE染色表皮厚度不均，角质层增厚，表皮真皮连接境界清楚，胶原纤维排列紊乱。证明皮肤光老化动物模型制备成功（图1）。

2.2 大体观察：治疗过程中可见明显的皮肤收缩，治疗完后以四环素眼膏外涂，每日3次。术后第1天，小鼠背部创面稍有红肿，无明显渗出。术后第2天，可见部分创面结痂。术后第3天，创面结痂，红肿基本消退，无渗出。术后第4天，创面痂皮出现脱落。术后第7天，创面痂皮基本脱落，可见少量毛发生长。术后第15天，创面完全愈合，毛发生长较快，皮肤色素及纹理较前减轻，创面无渗出等感染征象。

2.3 HE 染色：术后第1天，可见激光损伤灶周围变性组织及周围细胞水肿，真皮胶原纤维水肿（图2）。术后第3天，可见炎性细胞浸润，真皮胶原纤维水肿表皮细胞向创底迁移（图3）。术后第7天，激光损伤灶位置真皮层大量的炎性细胞浸润，变性胶原纤维处可见增生胶原纤维，损伤灶基底见表皮细胞增殖，损伤灶处表皮细胞呈多层分布（图4）。术后15天，真皮胶原纤维排列有序，紧密，表皮组织结构恢复，毛囊有增生（图5）。

2.3 电镜观察：电镜下观察皮肤成纤维细胞超微结构及胶原纤维的变化， 结果显示：光老化皮肤成纤维细胞线粒体肿胀膜性结构模糊，内质网扩张明显；胶原纤维分布不均匀，排列紊乱，周期性横纹消失；横断面可见胶原纤维直径大小不均（图6）。激光治疗术后第1天可见成纤维细胞线粒体体积增大，胶原纤维横纹不清楚，变性胶原纤维呈高电子密度团块，间隙增大（图7）；术后3天，成纤维细胞出现增生，线粒体体积增大，数量增多，胶原纤维见周期性横纹（图8）；术后第7天成纤维细胞增生活跃（图9），线粒体、粗面内质网丰富（图10、11），内质网扩张明显；胶原纤维增多增粗；术后第15天，成纤维细胞趋于正常，线粒体、粗面内质网较前减少，胶原纤维排列密集新生的胶原纤维分布丰富，周期性横纹清晰（图12）。

3讨论

光老化皮肤的主要组织学特征是皮肤基质构成的改变，即胶原蛋白成分的减少和异常弹性纤维蛋白沉积[1]。成纤维细胞是皮肤中最主要的细胞类型，细胞内的线粒体能为细胞的生命活动提供场所，是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所；粗面内质网合成分泌蛋白质，，成纤维细胞各种生物学特性的改变是皮肤光老化形成的最重要基础[2]。

紫外线照射皮肤可产生活性氧，降低皮肤成纤维细胞的活性及增殖能力，损伤线粒体[3]，胶原与弹性蛋白降解[4]，从而导致皮肤过早出现粗燥、皮沟加深、毛细血管扩张、色斑等损害性症状，严重影响了人们的外表。随着生活水平和审美标准的提高，人们对皮肤光老化的防治越来越重视。

在过去的20年中，超脉冲CO2激光换肤术被认为是治疗面部皮肤光老化的“金标准”[5]，2004年，Manstein等引入了激光嫩肤的新概念--点阵式光热分解作用[6]。点阵CO2激光其独特的作用形式--阵列样排列的微小光束作用于皮肤，形成柱形结构的微小热损伤区，极大的减少了术后副作用的发生，被广泛的应用于临床治疗面部光老化[7-8]，但目前其对皮肤超微结构的影响尚无相关报道。

笔者采用点阵CO2激光作用于小鼠光老化皮肤模型，观察激光术后创面愈合过程中皮肤成纤维细胞的超微结构及胶原纤维的变化规律。结果表明，小鼠的光老化皮肤表现为成纤维细胞内线粒体肿胀、粗面内质网扩张，胶原纤维胶分布不均匀，排列紊乱，周期性横纹消失，横断面可见胶原纤维直径大小不均；术后第1天成纤维细胞稀少，细胞内线粒体体积增大，粗面内质网扩张，胶原纤维横纹不清楚，胶原纤维灶性钙化坏死。术后第3天成纤维细胞出现增生，线粒体体积增大、数量增多，胶原纤维见周期性横纹；术后第7天成纤维细胞数量明显增多，胞体增大，具有三角形、梭行等多形性，胞质内充满扩张的大量粗面内质网，线粒体丰富，胶原纤维增粗增多；后第15天成纤维细胞形态基本正常，核仁明显，胶原纤维排列紧密，新生的胶原纤维分布丰富，周期性横纹清晰。在点阵CO2激光作用于光老化皮肤后创面的修复过程中，笔者先观察到成纤维细胞的线粒体出现体积增大，以后出现线粒体、粗面内质网数量增多，粗面内质网明显扩张，成纤维细胞增生，新生的胶原纤维，可以认为首先线粒体的功能增强，产生ATP的增多，为粗面内质网合成功能的增强，细胞的增殖提供动力支持，而后粗面内质网明显扩张，数量增多，合成与分泌蛋白能力的增强，为胶原纤维的新生，细胞的增殖提供物质支持。在点阵CO2激光作用皮肤光老化后创面的修复过程中，成纤维细胞内的线粒体及粗面内质网等超微结构的改变发挥着重要的作用。

Pires Oliveira 等[9]用半导体激光的照射成骨细胞，发现照射后的24h、48h后核周区域出现了密集的线粒体。增殖72h后，线粒体形态呈丝状到颗粒状改变，线粒体分布于整个细胞浆内，认为低能量激光可以改变线粒体活性，促进细胞的增殖。Paulo等[10]通过观察低能量激光照射皮肤伤口愈合情况，发现低能量激光促进伤口的愈合，增强了线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅱ（琥珀酸-Q还原酶）和Ⅳ（细胞色素氧化酶）的活性。笔者认为在本研究中点阵CO2激光作用于光老化皮肤后，线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅱ（琥珀酸-Q还原酶）和Ⅳ（细胞色素氧化酶）的活性增强，线粒体内膜的跨膜电位梯度和pH梯度的增加，致使质子动力势（即电化学梯度）增加，线粒体氧化还原状态改变，加速了跨膜物质转运，从而加快的电子传递反应，增加了ATP合成。线粒体氧化还原状态及能量代谢的改变，引起一系列细胞效应，促进创面的修复。

点阵CO2激光治疗皮肤光老化后皮肤自我修复过程中，引起成纤维细胞中超微结构变化的分子调控机制，仍需要笔者的进一步研究。

[参考文献]

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[9]Pires Oliveira DA，de Oliveira RF，Zangaro RA，et al. Evaluation of low-level laser therapy of osteoblastic cells[J].Photomed Laser Surg，2008，26（4）：401-404.

[10]PCL.Silveira， Emilio L.Streck ， Ricardo A.Pinho，et al. Evaluation of mitochondrial respiratory chain activity in wound healing by low-level laser therapy[J].J Photoch Photobio B，2007，86（3）：279-282.

[收稿日期]2012-06-29[修回日期]2012-08-14

编辑/张惠娟