云南高原湿地植物水葱的ITS序列分析

于瑶　张汉尧　杜建伟

摘要：提取分布于云南高原湿地的水葱（Scirpus validus Vahl.）样品的DNA，采用ITS 序列扩增通用引物，对其进行PCR 扩增，并对PCR产物进行测序。从GenBank搜索并下载水葱属其他种类的ITS序列，并通过BioEdit、ClustalX 2.02和MEGA 4x1软件分析和构建系统发育树。分析结果揭示了水葱属14个种之间的亲缘关系，并确定了样品在种间的位置以及和其他种的亲缘关系。

关键词：水葱（Scirpus validus Vahl.）；ITS序列；系统发育树

中图分类号：Q523+.8；Q949.71+4.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）20-4549-02

湿地生态系统是一类重要的自然生态系统，中国云贵高原、青藏高原分布着不同海拔的高原湿地。植被和植物群落特征是显示高原湖泊湿地的自然性、特殊性、多样性、演变阶段、消退阶段的最好指示要素。水葱是云南高原湿地挺水植被群落中常见的分布最为广泛的优势群落。水葱的拉丁学名为Scirpus validus Vahl.，为莎草科多年生宿根挺水草本植物，生长在湖边、水边、浅水塘、沼泽地或湿地草丛中，在中国南北方分布广泛，是构建人工湿地系统、进行污水净化的常用挺水植物，也是常用的景观绿化植被。

ITS序列是在rDNA基因中16 S rDNA和28 S rDNA基因的间隔序列，也被称为内转录间隔区，ITS 序列在被子植物中的长度变异很小，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。因此，其常被用于研究被子植物系统发育关系，尤其是近缘属间及种间关系[1-3]。ITS序列和matK、rbcL序列[4]一样都是在研究物种遗传多样性、系统发育、物种起源及物种确定上常用的依据[5-8]。

本研究以分布于云南高原湿地中的水葱为样品，通过克隆其基因组DNA的ITS片段，并与NCBI上已收录的其他水葱属各种植物的ITS序列比较。明确其在水葱属各种间的系统发育树上的位置，为水葱的遗传改良及研究水葱属种间的系统发育提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

试验材料采集于云南省大理州剑川县的剑湖。采集地水葱株高1～2 m，茎杆高大通直，杆呈圆柱状，中空，多散生。

1.2方法

1.2.1总DNA的提取采用新鲜幼嫩的水葱水上部分，放入液氮中研磨成粉末，用生工生物工程（上海）股份有限公司的植物基因组提取试剂盒提取高质量的水葱总DNA。

1.2.2PCR扩增参考文献[8]，PCR反应体系包括由北京百泰克生物技术有限公司合成的ITS通用引物JK5.8F（5′-GAT ACT TGG TGT GAA TTG CAG A-3′）、ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）各2 μL，双链DNA模板2 μL，北京百泰克生物技术有限公司生产的2×Power Taq PCR MasterMix 25 μL，用去离子水补足至50 μL。扩增条件为：95 ℃预变性6 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共40个循环；最后于72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶、0.5×TBE电泳缓冲液中电泳，电压不超过5 V/cm，用溴化乙锭（EB）浸染，在UVP凝胶成像仪上观察并摄影。用回收试剂盒回收纯化扩增片段，纯化后直接作为测序用模板。

1.2.3DNA的序列分析首先用BioEdit软件对测序结果进行调整，转换格式，利用ClustalX 2.02软件完成DNA序列的对比，保存ALN格式，然后运用MEGA 4x1软件进行系统发育分析，应用自展法（Bootstrap，1 000 Replicates）进行可信度检测，对空位做缺失处理，使用1 000次重复抽样计算邻接树（Neighbor-joining tree，NJ），模型选择核算P-distance，构建水葱属各种之间的系统发育树。

2结果与分析

2.1样品PCR扩增后的电泳结果

采集水葱样本，提取基因组DNA，用PCR扩增后获得了单一的目的条带，获得的样品的ITS区域的序列片段长度为500 bp，PCR扩增获得的目的片段为5.8 S rDNA片段、大部分ITS2和少量ITS1片段。在GenBank中利用BLAST对比获得水葱属的其他相关种的ITS序列共计13个（表1）。

2.2样品ITS的序列分析结果

由于本试验扩增出来的为样品的ITS部分片段，所以在经软件ClustalX 2.02和MEGA 4x1分析时均选用水葱属中各种的相同ITS片段进行序列分析，分析结果表明，本试验所用的14种水葱属的植物样品的ITS片段有364个核苷酸位点，263个恒定信息位点，98个变异信息位点，51个简约信息位点，46个单个碱基变化位点。该序列的变异信息位点所占比例仅为26.9%。说明水葱的ITS序列变异不大，而且具有较多的遗传信息，适用于进行遗传分析。

2.3水葱属植物ITS序列的聚类分析结果

用ClustalX 2.02软件对14个样本的ITS序列进行了聚类分析，建立了其系统发育树（图1）。从聚类分析结果来看，可以把水葱属这14个样本分为两大分支，其中Schoenoplectus gitriqueter（三棱水葱）、S. nipponicus和本试验样品为一个分支，其余各样本为一个分支，其中本试验样品与S. gitriqueter亲缘关系最近，并且又与S. nipponicus聚为一类。但本试验样本与S. gitriqueter的自展支持率为100%，所以确定为一个独立的类群。

3讨论

水葱作为中国高原湿地中常见的分布广泛的挺水优势群落，是很好的环境指示植物，并对于湿地水体净化、水生植被演替都有重要的意义，同时也是重要的湿地景观植物。但国内外相关研究却较少。水葱属有很多种类，但都没有系统归类和鉴别，如研究所检索到的这14种都没有很好的中文译名和鉴别。特别是关于水葱的分子生物学的研究，属内各种的明确定位以及遗传关系基本空白。通过ITS序列分析可知，本试验样品虽然与三棱水葱亲缘关系最近，但自展支持率为100%，所以很可能是一个独立的类群。希望以后有更多的关于水葱属植物以及其他高原湿地植物的研究，以丰富中国高原湿地植被的知识，为中国高原湿地植物的保护和利用奠定分子生物学基础。

参考文献：

[1] 王建波，陈家宽.核rRNA的ITS序列在被子植物系统与进化研究的应用[J].植物分类学报，1999，37（4）：407-416.

[2] 王小全，洪德.植物分子系统学近五年的研究进展概况[J].植物分类学报，1997，35（5）：465-480.

[3] 赵志礼，董辉.核糖体DNA ITS区序列在植物分子系统学研究中的价值[J].植物资源与环境学报，2000，9（2）：50-54.

[4] 李晓贤，周浙昆.单子叶植物高级分类阶元系统演化：matK、rbcL和18 S rDNA序列的证据[J]. 植物分类学报，2007，45（2）：113-133.

[5] 史全良，诸葛强，黄敏仁，等.用ITS序列研究杨属各组之间的系统发育关系[J].植物学报，2001，43（3）：323-325.

[6] 刘华晶，许修宏，姜廷波，等.基于ITS序列分析探讨大兴安岭地区野生黑木耳菌株的遗传多样性[J].四川农业大学学报，2011， 29（1）：41-44.

[7] 赵卫国，潘一乐，张志芳. 桑属植物ITS 序列研究与系统发育分析[J].蚕业科学，2004，30（1）：11-13.

[8] 赵志国.基于生物信息技术对部分禾本科植物系统分类研究[D].山西太谷：山西农业大学，2005.