三种miRNA血清水平与非小细胞肺癌的相关性研究

陈飞 卢火佺 臧发荣 周雪锋

[摘要] 目的 探讨血清中let—7、miR—125b—1、miR—21水平与非小细胞肺癌（NSCLC）的相关性。 方法 收集NSCLC患者与健康对照人群的血清，通过荧光定量PCR检测并比较外周血let—7、miR—125b—1、miR—21的表达水平。 结果 let—7、miR—125b—1表达量在NSCLC患者血清中均低于对照组，而miR—21表达量显著高于对照组，差异均有统计学意义（均为P < 0.01）。其与健康对照组血清的比值平均为21.1%、13.5%、207.4%。 结论 外周血let—7、miR—125b—1、miR—21水平可能成为一种新的生物标记物用于NSCLC的早期诊断。

[关键词] 非小细胞肺癌；miRNA；血清；早期诊断

[中图分类号] R734.2[文献标识码] B[文章编号] 1673—9701（2012）25—0056—02

Correlation study on serum levels of three miRNA and early diagnosis of non—small cell lung cancer

CHEN Fei LU Huoquan ZANG Farong ZHOU Xuefeng

Department of Respiratory Medicine， Changxing County Peoples Hospital in Zhejiang Province， Changxing 313100， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation of let—7， miR—125b—1， miR—21 level in the peripheral blood and non—small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Serum of NSCLC patients and healthy control subjects were collected. Let—7， miR—125b—1 and miR—21 levels were detected by fluorescence quantitative PCR and compared. Results Serum let—7， miR—125b—1 levels in NSCLC patients were significantly decreased， while miR—21 expression was significantly increased （both P < 0.01） than that in the healthy controls. The average ratio of let—7， miR—125b—1 and miR—21 level in the patients and the controls were 21.1% 13.5% and 207.4%， respectively. Conclusion Let—7， miR—125b—1 and miR—21 levels in the peripheral blood may be new biomarkers for early diagnosis of NSCLC.

[Key words] Non—small cell lung cancer； miRNA； Serum； Early diagnosis

肺癌的死亡率在很多国家和地区居首位，其5年存活率多年来无显著改善，这与缺乏有效的早期诊断与治疗手段有关。miRNA是一种长度为18—24核苷酸的内源性小分子RNA，可与靶基因mRNA的3'端互补区结合，调控靶基因的表达与翻译，参与细胞增殖、分化、发育、凋亡等一系列生命活动。研究发现，miRNA还起到原癌基因、抑癌基因的作用，并具有明显的肿瘤组织特异性与表达稳定性[1]。let—7、miR—125b—1、miR—21等与非小细胞肺癌（NSCLC）的关系密切，在肺癌组织中表达量显著异常[2，3]，有望成为NSCLC的早期诊断标志物，但其血液中表达水平与NSCLC的关系尚不明确。本文即探讨let—7、miR—125b—1、miR—21在血液中的表达水平与NSCLC发生的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

56例液氮保存的血清标本来自我院2007年2月～2010年10月收治的非小细胞肺癌患者，其中男43例，女13例，年龄35～71岁，平均53.9岁。患者术前均未行肿瘤化疗。诊断符合WHO非小细胞肺癌诊断标准（1999年第3版）。另取同期无肺部病变健康体检者血清56例作对照，其中男41例，女15例，年龄22～64岁，平均52.1岁。两组人群的性别构成、平均年龄差异无统计学意义。

1.2 材料

miRcute miRNA提取分离试剂盒购自天根公司：逆转录试剂盒与SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒购自日本TaKaRa公司。let—7、miR—125b—1、miR—21及表达内参miR—22引物均购自广州市锐博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA样本的制备冻存的血清标本快速复温，取400 μL融解血清按照miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书要求提取，RNA最终用DEPC水溶解，紫外分光光度计检测提取的RNA纯度，OD260/OD280比值>1.8。

1.3.2 逆转录以逆转录PCR反应扩增目标基因，采用20 μL反应体系：dNTP mix（100 mmol/L）0.2 μL，Multiscribe逆转录酶（50 U/μL）1.0 μL，10×逆转录缓冲液2 μL，RNA酶抑制剂（20 U/μL）1 μL，去核酸酶水9.8 μL，混合逆转引物1 μL引物，5 μL RNA。根据TaKaRa公司试剂盒说明书操作，轻轻混匀，短暂离心，冰上放置。RT—PCR反应条件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。

1.3.3 荧光定量PCR总反应体系为20μL：2×SYBR Green荧光定量预混液10 μL，上述扩增的cDNA（1∶20稀释）2 μL，去核酸酶水7.0 μL，引物1 μL。通过Roche Light Cyeler 480实时荧光定量PCR系统进行检测。反应参数：95℃，1 min；95℃，15 s；60℃，45 s共40个循环。

1.4 统计学方法

3种miRNA表达结果以miR—22的表达水平为内参，随机以其中一个血清样品为阳性对照。利用SPSS 13.0统计学软件对实时荧光定量PCR检测的相对表达量进行分析，表达量的相对比值以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

NSCLC患者与健康人群的血清RNA进行逆转录扩增后，行荧光定量PCR检测各miRNA的表达量，以miR—22为内参计算其相对比值。let—7、miR—125b—1表达量在NSCLC患者血清中均低于对照组，miR—21表达量显著高于对照组（均为P < 0.01），见表1。其与健康对照者血清的比值平均为21.1%、13.5%、207.4%，见图1。提示let—7、miR—125b—1、miR—21的表达水平可能成为NSCLC患者的血清标记物。

表1 三种miRNA在NSCLC患者与健康人群血清表达量（x±s）

图1 三种miRNA在NSCLC患者与健康人群血清中的表达

3 讨论

肿瘤的早期发现与治疗是降低其死亡率的关键。但多数肿瘤缺乏高度敏感和特异的标记物[4]，因此寻找肿瘤早期发生的标记物一直是肿瘤学研究的热点。外周血肿瘤标记物的检测具有几乎无创、可进行重复多次测定的优点，是肿瘤诊断的较理想手段。研究发现，外周血miRNA的表达具有肿瘤相关性与组织特异性的特点[5]。miRNA对外周血核糖核酸酶稳定，因此较RNA更为稳定，甚至在室温下过夜、反复冻存—解冻、煮沸、过酸或过碱等条件下仍能稳定表达[6]。故外周血miRNA可能是较理想的肿瘤标记物。

let—7是研究最多的与肺癌密切相关的miRNA。超过60%的肺癌组织与80%的肺癌细胞株中let—7的表达水平显著降低[7]，并且let—7低表达的肺癌患者预后不良。国外研究发现，let—7在胚胎末期表达上调，在肿瘤早期表达降低[8]，且表达减少在NSCLC更为常见。Scott等发现let—7低表达是相对早期癌症的标识[1]。流行病学调查发现，let—7在KRAS 3′端非翻译区的基因突变与NSCLC的好发有关[9]。我们的研究发现，let—7在NSCLC患者外周血的水平仅为正常健康人群的21.1%，提示外周血let—7可能是一种较好的与NSCLC有关的肿瘤标记物。

miR—125b—1与肺癌的发生相关。此miRNA定位于11q23—24杂合型缺失的微小区域，后者在肺部、乳腺和卵巢肿瘤中存在突变或缺失。miRNA基因的突变或缺失可影响其表达水平。国内研究发现，miR—125b—1在癌旁正常肺组织中无异常，在肺癌组织中存在基因突变，且miR—125b—1基因突变与癌的淋巴结转移及临床分期呈显著正相关[10]。在本研究中，外周血miR—125b—1在肺癌患者中显著降低，仅为健康人群的13.5%，提示miR—125b—1与肺癌的发生高度相关。

miR—21在多种肿瘤细胞中表达异常。在大多数肿瘤中，如恶性胶质瘤、肺癌、乳腺癌、胆道癌、胰腺癌、直肠癌、膀胱癌及食管癌细胞或组织中，miR—21的表达均显著升高。但在少数肿瘤，如卵巢癌、促肾上腺皮质素分泌型垂体瘤等中表达明显降低。研究发现，通过miR—21区分胆管癌与正常组织的灵敏度可达95%，提示miR—21可用于胆管癌的诊断[11]。通过计算miR—21与miR—205的表达量比值，可对侵袭性与非侵袭性的膀胱癌细胞进行有效的判别，其临床灵敏度和特异性可分别达到100%和78%。在本研究中，NSCLC患者外周血miR—21大幅升高，提示其与肺癌的发生密切相关。但由于miR—21在多种肿瘤中高表达，其在外周血的表达水平与其他肿瘤的相关性尚需进一步研究。

[参考文献]

[1]Shell S，Park SM，Radjabi AR，et al. Let—7 expression defines two differentiation stages of cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（27）：11400—11405.

[2]任为正，叶鸿飞，赵健，等. MicroRNA let—7与肺癌关系的研究进展[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16（4）：418—421.

[3]龚柳阳，吴小脉，冯加喜. 肺癌相关microRNA的研究进展[J]. 中国肺癌杂志，2009，12（9）：1032—1035.

[4]Rifai N，Gillette MA，Carr SA. Protein biomarker discovery and validation： the long and uncertain path to clinical utility[J]. Nat Biotechnol，2006，24（8）：971—983.

[5]Cho WC. OncomiRs： the discovery and progress of microRNAs in cancers[J]. Mol Cancer，2007，6：60.

[6]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al. Circulating microRNAs as stable blood—based markers for cancer detection[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（30）：10513—10518.

[7]Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al. Reduced expression of the let—7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J]. Cancer Res，2004，64（11）：3753—3756.

[8]Boyerinas B，Park SM，Shomron N，et al. Identification of let—7—regulated oncofetal genes[J]. Cancer Res，2008，68（8）：2587—2591.

[9]Chin LJ，Ratner E，Leng S，et al. A SNP in a let—7 microRNA complementary site in the KRAS 3untranslated region increases non—small cell lung cancer risk[J]. Cancer Res，2008，68（20）：8535—8540.

[10]苏琳，李冠华，霍学云，等. 肺癌组织miR—125b—1基因突变的初步分析[J]. 现代预防医学，2008，35（2）：355—356，359.

[11]Selaru FM，Olaru AV，Kan T，et al. MicroRNA—21 is overexpressed in human cholangiocarcinoma and regulates programmed cell death 4 and tissue inhibitor of metalloproteinase 3[J]. Hepatology，2009，49（5）：1595—l601.

（收稿日期：2011—03—07）