柽柳过氧化物酶基因的序列分析及山新杨遗传转化研究

郭晓红 洪艳华 韩文革 郑桂萍 吕艳东

摘要：对刚毛柽柳（Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ）的过氧化物酶基因（ＴｈＰＯＤ）全长序列进行分析，结果表明，该基因全长为１ ３７６ ｂｐ，包含一个１ ０８６ ｂｐ的开放阅读框，可编码３６１个氨基酸残基，蛋白分子质量为３９．３ ｋｕ。根据ＴｈＰＯＤ基因保守序列设计特异引物克隆该基因，并成功构建了ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ植物过表达载体，利用农杆菌介导法转化山新杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ），经ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定，初步证明外源基因ＴｈＰＯＤ已整合到山新杨的基因组中并在转录水平上进行了表达。

关键词：柽柳（Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ）；过氧化物酶基因（ＴｈＰＯＤ）；山新杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ）；遗传转化

中图分类号：Ｓ７９３．５；Ｑ５５４＋．６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）03－0615-05

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Iｎｔｏ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ ×Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ

ＧＵＯ Ｘｉａｏ－ｈｏｎｇ，ＨＯＮＧ Ｙａｎ－ｈｕａ，ＨＡＮ Ｗｅｎ－ｇｅ，ＺＨＥＮＧ Ｇｕｉ－ｐｉｎｇ，Ｌ?譈 Ｙａｎ－ｄｏｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ １６３３１９，Ｈｅiｌｏｎｇｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴｈＰＯＤ ｇｅｎｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ ｒｏｏｔ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＴｈＰＯＤ ｗａｓ １ ３７６ ｋｂ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ １ ０８６ ｂｐ ＯＲＦ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ＴｈＰＯＤ ｗａｓ ３９．３ ｋｕ ｗｉｔｈ ３６１ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＴｈＰＯＤ． Ｐｌａｎｔ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓion ｖｅｃｔｏｒ ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ； Aｎｄ ｔｈｅ ＴｈＰＯＤ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ＰＣＲ ａｎｄ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＴｈＰＯＤ ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ； ＴｈＰＯＤ； Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ； ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ

过氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ，ＥＣ１．１１．１．７）是广泛存在于动物、植物和微生物体内的一类氧化还原类酶，主要与过氧化氢的清除有关［１］。该酶参与众多的植物生理过程，在植物的生长发育、抵御生物和非生物胁迫方面起着一定作用［２－６］。目前，已对模式植物如拟南芥、水稻、烟草等的过氧化物酶的基因序列、表达模式、酶学性质及生理功能等方面进行了研究［７－９］，但在木本植物中鲜有报道。

刚毛柽柳（Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ）属柽柳科柽柳属，广泛分布于砾石戈壁、粘土、沙土、流沙及各种不同程度的盐渍化土壤，具有抗旱、耐盐碱、耐沙埋、耐贫瘠的特点，是荒漠地区盐渍化沙地上良好的固沙造林树种，也是进行植物抗干旱和耐盐碱基因克隆的理想材料之一。ＴｈＰＯＤ是从ＮａＣｌ胁迫条件下刚毛柽柳根的ｃＤＮＡ文库中分离到的编码过氧化物酶的基因，属于植物过氧化物酶基因家族成员之一，能够被干旱、盐和冷及重金属（ＣｄＣｌ２）等非生物胁迫因子所诱导，且能保护大肠杆菌细胞免于非生物胁迫［１０－１２］。本研究对前期研究获得的ＴｈＰＯＤ序列进行了生物信息学分析，并利用农杆菌叶盘法将该基因转入山新杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ），以期为进一步研究过氧化物酶在植物对逆境的响应等的分子调控机理以及利用基因工程技术改良林木品种奠定基础。

１材料与方法

１．１材料和试剂

根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９菌株为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存；植物表达载体ｐＲＯＫⅡ由山东农业大学张慧教授惠赠；ｐＭＤ１８Ｔ－ ＴｈＰＯＤ质粒、ｐＥＴ３２ａ－ＴｈＰＯＤ质粒由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室姜静教授惠赠；限制性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ、Ｅｘ Ｔａｑ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ等购自ＭＢＩ，质粒（小量）提取试剂盒、胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００购自宝生物工程（大连）有限公司。卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ，Ｋｍ）购自Ｓｉｇｍａ公司，其他化学试剂等购自国内生产厂家，均为分析纯。

１．２方法

１．２．１ＴｈＰＯＤ序列生物信息学分析用ＮＣＢＩ的ＯＲＦ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）软件寻找ＴｈＰＯＤ的开放阅读框；采用ＥｘＰＡＳｙ的ＰｒｏｔＰａｒａｍ Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）分析ＴｈＰＯＤ的理化性质；用Ｐｒｏｓｉｔｅ软件（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏ－ｓｉｔｅ）预测编码蛋白的特定功能位点；Ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ预测ＴｈＰＯＤ氨基酸序列的二级结构（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）；用Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇｎａｌ Ｐ）进行蛋白质序列中信号肽的预测分析。

１．２．２ＴｈＰＯＤ基因的分离根据已获得的ＴｈＰＯＤ基因保守序列，利用Ｏｌｉｇｏ６．０软件设计一对ＰＣＲ特异扩增引物扩增ＴｈＰＯＤ的开放阅读框，由上海英骏生物技术有限公司合成。上下游引物序列分别为：上游引物５′－ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡ

ＴＣＡＧＣＡＧＴ－３′，下游引物５′－ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＡＴＴＣ

ＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＴＡＣ－３′（划线部分分别为Ｂａｍ ＨⅠ和ＳａｃⅠ的酶切位点）。ＰＣＲ反应体系为２０ μＬ，包括１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１０ Ｕ／μＬ ＥｘＴａｑ、上下游引物各５ ｍｏｌ／Ｌ、模板ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ ６０ ｎｇ。ＰＣＲ扩增条件为：９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５６ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸６０ ｓ，３０个循环；７２ ℃，７ ｍｉｎ。

１．２．３植物表达载体的构建及鉴定质粒ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ经限制性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ消化后回收小片段，植物表达载体ｐＲＯＫⅡ经ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ消化后回收大片段，将两个片段经Ｔ４连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９感受态细胞，在含５０ ｍｇ／Ｌ Ｋｍ的ＬＢ平板上筛选阳性菌落，碱裂解法提取质粒，利用ＰＣＲ、酶切及测序进一步确认目的片段是否连接到ｐＲＯＫⅡ载体上。将ＰＣＲ扩增、酶切鉴定均为阳性及测序正确的质粒命名为ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ。重组质粒ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ通过电击法转入根癌农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞，在含有５０ ｍｇ／Ｌ Ｒｉｆ和５０ ｍｇ／Ｌ Ｋｍ的ＹＥＢ平板上筛选阳性克隆，使用碱裂解法提取质粒并进行酶切鉴定。

１．２．４农杆菌介导的山新杨遗传转化菌种的活化和工程菌液的制备按文献［１３］所述方法进行，参照文献［１４，１５］的方法进行遗传转化。

１．２．５转基因山新杨植株的检测①ＤＮＡ提取及ＰＣＲ的检测。取转化的山新杨植株幼嫩叶片，ＣＴＡＢ法提取总ＤＮＡ。１０ μＬ ＰＣＲ反应体系包括：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，ＭｇＣｌ２ ０．６ μＬ，上下游引物（５ ｍｍｏＬ／Ｌ）各１．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏＬ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｅｘ Ｔａｑ（１０ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，模板ＤＮＡ（５０ ｎｇ）１．０ μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性４０ ｓ，５６ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃保温７ ｍｉｎ。ＰＣＲ 产物用１．５％的琼脂糖凝胶电泳检测，以ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ质粒为阳性对照，以未经转化的山新杨植株试管苗总ＤＮＡ为阴性对照，同时设纯水对照，对转化再生植株进行ＰＣＲ扩增检测。②Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交检测。采用ＳＤＳ法［１６］提取转基因和非转基因对照山新杨的总ＲＮＡ，在０．８％的甲醛变性胶上进行电泳，采用虹吸法将ＲＮＡ转移到尼龙膜上，按标准的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法进行杂交和检测［１７］。

２结果与分析

２．１柽柳ＴｈＰＯＤ基因生物信息学分析

２．１．１ｃＤＮＡ及氨基酸序列分析ＴｈＰＯＤ全长为１ ３７６ ｂｐ，其中５端非翻译区１６３ ｂｐ，３端非翻译区９６ ｂｐ，１ ３４７－１ ３７6位为Ｐｏｌｙ（Ａ）尾（图1）。开放阅读框编码由３６１个氨基酸残基组成的多肽。氨基酸序列的分子量为３９．３ ｋｕ，理论等电点为６．５９。编码的蛋白为酸性蛋白质。负电荷残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）数为３５，正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）数为３４个，不稳定系数为３７．１７，为稳定的蛋白质。

２．１．２ＴｈＰＯＤ二级结构的预测和分析用ＳＯＰＭＡ预测ＴｈＰＯＤ氨基酸序列的二级结构（图2），α－螺旋和不规则卷曲是ＴｈＰＯＤ主要的结构元件，而β－转角和延伸链则散布于整个蛋白质中。统计表明，ＴｈＰＯＤ的二级结构由３９．６１％的α－螺旋、３９．３４％的不规则卷曲、１６．０７％的延伸链和４．９９％的β－转角组成。与豇豆、菠菜、烟草、大戟属和拟南芥ＰＯＤ的二级结构相同，这说明ＰＯＤ的二级结构是高度保守的，与刘稳等［１８］报道的结果一致。

２．１．３其他预测结果ＳＭＡＲＴ和ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ分析结果表明，ＴｈＰＯＤ还具有过氧化物酶超家族的其他特征基序，如４个保守的二硫化物桥（５１－１３２，８４－８９，１３８－３３３，２１８－２４５）和２个保守的钙绑定位点（２１２，２６５）。除此之外，该基因包含４个Ｎ－糖基化位点（１１０－１１３，ＮＬＴＬ；１８６－１８９，ＮＡＴＴ；２５２－２５５，ＮＴＴＶ；３０１－３０４：ＮＱＳＬ），４个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点（１１２－１１４，ＴLＲ； ２３３－２３５，ＴDＫ； ２９０－２９２，ＴTＫ； ３４０－３４２，ＳFＫ），６个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（１３７－１４０，ＳCAＤ； ２５４－２５７， ＴVLＤ； ２８０－２８３， ＴSDＥ； ２８１－２８４，ＳDEＤ； ３２５－３２８，ＴQQＥ； ３４５－３４８，ＳVVＤ），２个氨基化位点（１６２－１６５，LＧＲＲ；３５５－３５８，YＧＲＲ），一个依赖于ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ的蛋白激酶磷酸化位点（１６４－１６７，ＲＲDＳ）和５个肉豆蔻酰化位点（４１－４６，ＧＬSWＳＦ；７１－７６，ＧＱAAＧＬ；８８－９３，ＧＣDGＳＶ；２１９－２２４，ＧＳFTＮＷ；２７７－２８２，ＧＬFTＳＤ）。此外，该基因所编码的蛋白为分泌型蛋白且有信号肽。

２．２ＴｈＰＯＤ基因开放阅读框的获得

以质粒ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ为模板，用设计的特异引物进行ＰＣＲ，扩增出长约１ ０８６ ｂｐ的ＤＮＡ片段（图3），与预期的片段长度相符，阴性对照没有扩增出条带，初步确定获得的片段为ＴｈＰＯＤ基因的开放阅读框。

２．３ＴｈＰＯＤ基因植物表达载体的构建及鉴定

ＰＣＲ产物及ｐＲＯＫⅡ载体经ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ进行双酶切后，连接并转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，在含有５０ μｇ／ｍＬ Ｋｍ的平板上挑取阳性菌落，ＬＢ液体培养基培养并抽提质粒，利用特异引物进行ＰＣＲ扩增，质粒扩增结果与以ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ质粒为模板扩增得到的片段大小一致（图略）；同时利用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ对质粒进行双酶切，结果显示在１ ０８６ ｂｐ处有一特异片段（图４），表明目的片段已成功地插入表达载体。经序列测定证实插入片段为ＴｈＰＯＤ开放阅读框序列，且序列完全、正确。

２．４农杆菌介导的山新杨遗传转化

采用电转化法将ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ载体直接转化农杆菌ＥＨＡ１０５，用ＴｈＰＯＤ基因的特异引物ＰＣＲ扩增鉴定农杆菌质粒中目的基因的存在。从图５可知农杆菌质粒与大肠杆菌质粒ＰＣＲ结果相一致，说明植物表达载体ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ已转化到农杆菌中。经愈伤诱导、共培养、筛选、预分化、分化得到１７株转基因山新杨苗。

２．５转基因山新杨的检测

用ＣＴＡＢ法提取１７株转基因植株及非转基因对照植株的基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＴｈＰＯＤ基因开放阅读框的特异引物进行ＰＣＲ扩增，检测ＴｈＰＯＤ是否整合到了山新杨基因组中。以非转化植株和纯水做阴性对照，所得琼脂糖凝胶电泳结果见图６。从图６可以看出，１７个卡那霉素抗性植株中有１４株可以扩增出目的条带，而非转化植株和纯水阴性对照中均没有扩增出产物，结果初步证明已获得１４株含外源ＴｈＰＯＤ基因的山新杨转化植株，将其分别命名为ＴＬ１－ＴＬ１４。

为检测阳性转基因植株在转录水平的表达，以非转基因山新杨植株为阴性对照，对阳性转基因植株进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。采用ＣＴＡＢ法提取转基因（ＴＬ１，ＴＬ３，ＴＬ５，ＴＬ８，ＴＬ１２）和非转基因山新杨叶片总ＲＮＡ，用ＤＮａｓｅⅠ消化后经凝胶电泳检测符合实验要求（图７）。采用ＤＩＧ标记的ＴｈＰＯＤ的特异性探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ，结果表明柽柳ＴｈＰＯＤ在转基因山新杨植株的叶片中进行了转录，非转基因植株未出现杂交信号。

３结论与讨论

过氧化物酶目前已在棉花［１９］、小麦［２０］、甘薯［２１］、针叶树［２２］等植物中分离。在高等植物中，过氧化物酶是被多基因家族编码的，过氧化物酶超家族的所有成员均参与以过氧化氢作为电子受体的多步氧化反应，该类酶主要存在于植物的细胞外和液泡膜空间，参与过氧化氢的脱毒、植物激素代谢、木质素的生物合成和胁迫反应［１］。研究表明ＴｈＰＯＤ响应于盐、冷、干旱、重金属胁迫及ＡＢＡ处理，与植物抗逆性的调控相关。因此可以推断ＴｈＰＯＤ是一个与逆境胁迫相关的基因［１１，１２］。生物信息学分析表明，ＴｈＰＯＤ基因具有过氧化物酶超家族的特征基序，其二级结构也是高度保守的。

对过氧化物酶基因进行基因工程研究已经取得了一定的成果。Ｋｉｍ等［２３］通过农杆菌介导法将甜薯过氧化物酶基因（ｓｗｐａ４）转入烟草植株中，转基因植株过氧化物酶活性是对照植株酶活的５０倍，该基因的过表达能够提高烟草对盐胁迫、氧化胁迫以及干旱胁迫的耐性，并推测该基因在过氧化氢调控的胁迫响应信号通路中可能起到一个有利的防御信号的作用。可见采用基因工程手段，通过过量表达可清除活性氧自由基的抗氧化解毒酶，可以提高植物抗氧化胁迫的能力，继而提高植物耐性。本研究将克隆获得的ＴｈＰＯＤ基因开放阅读框构建到植物表达载体ｐＲＯＫⅡ中ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的下游，构建了ＴｈＰＯＤ基因过表达载体，通过农杆菌介导法转化山新杨，共获得１７个卡那霉素抗性植株，ＰＣＲ检测结果显示其中１４个转化植株为阳性，从中选取５个转化子进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定，结果证实ＴｈＰＯＤ基因已经整合到山新杨基因组中并能够转录出ｍＲＮＡ。本研究为进一步研究该基因的生物学功能，并深入了解过氧化物酶在植物对逆境的响应等方面的分子调控机理以及利用基因工程技术改良林木品种奠定了基础。

参考文献：

［１］ ＰＡＳＳＡＲＤＩ Ｆ， ＣＯＳＩＯ Ｃ， ＰＥＮＥＬ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ ｈａｖｅ ｍｏｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｎ ａ Sｗｉｓｓ ａｒｍｙ ｋｎｉｆｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００５，２４（５）：２５５－２６５．

［２］ ＰＡＳＳＡＲＤＩ Ｆ， ＰＥＮＥＬ Ｃ， ＤＵＮＡＮＤ Ｃ． Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ：Ｈｏｗ ｐｌａｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ ｍｏｄｉｆｙ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ［Ｊ］． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，９（１１）：５３４－５４０．

［３］ Ｌ ＰＥＺ-ＳＥＲＲＡＮＯ Ｍ， ＦＥＲＮ ＮＤＥＺ Ｍ Ｄ， ＰＯＭＡＲ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ ｕｓｅｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｔｈ ｓｉｎｇｌｅ-ｃｅｌｌ ｔｒａｃｈｅａｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｘｙｌｅｍ ｖｅｓｓｅｌｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，２００４， ５５（３９６）：４２３－４３１．

［４］ ＲＡＮＩＥＲＩ Ａ， ＰＥＴＡＣＣＯ Ｆ， ＣＡＳＴＡＧＮＡ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｏｚｏｎｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，１５９（１）：１５９－１６７．

［５］ ＤＥＬＡＮＮＯＹ Ｅ， ＪＡＬＬＯＵＬ Ａ， ＡＳＳＩＧＢＥＴＳＥ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ－ｍｉｃｒｏｂｅ Iｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２００３，１６（１１）：１０３０－１０３８．

［６］ ＤＯＷＤ Ｐ Ｆ， ＪＯＨＮＳＯＮ Ｅ Ｔ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ ｗｉｔｈ ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ， ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｚｙｍｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，５３（１１）：４４６４－４４７０．

［７］ ＭＡＲＪＡＭＡＡ Ｋ， ＨＩＬＤ Ｎ Ｋ， ＫＵＫＫＯＬＡ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｌｉｇｎｉｆｙｉｎｇ ｘｙｌｅｍ ｏｆ Nｏｒｗａｙ ｓｐｒｕｃｅ （Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Mｏｌｅｃｕｌａｒ Bｉｏｌｏｇｙ，２００６，６１（４）：７１９－７３２．

［８］ ＨＩＲＡＧＡ Ｓ， ＹＡＭＡＭＯＴＯ Ｋ， ＩＴＯ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｖｅｒｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ２１ ｒｉｃｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４７１（２－３）：２４５－２５０．

［９］ ＶＡＬ ＲＩＯ Ｌ， ＤＥ ＭＥＹＥＲ Ｍ， ＰＥＮＥＬ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｃ ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４，６５（１０）：１３３１－１３４２．

［１０］ 李慧玉，刘桂丰，刘菲菲，等． 柽柳ｃＤＮＡ文库的构建及ＴｈＡＱＰ基因的表达［Ｊ］． 西北农林科技大学学报（自然科学版）， ２０１１，３８（７）：１６１－１６６．

［１１］ ＧＵＯ Ｘ Ｈ， ＪＩＡＮＧ Ｊ， ＷＡＮＧ Ｂ Ｃ， ｅｔ ａｌ． ＴｈＰＯＤ３， ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ， ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１０，３７（３）：１１８３－１１９０．

［１２］ ＧＡＯ Ｃ，ＷＡＮＧ Ｙ，ＬＩＵ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ＰＯＤ） ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ， ２０１０，２８（１）：７７－８９．

［１３］ ＤＲＥＷ Ｍ， ＳＡＫＥＲ Ｌ． Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｕｐｐｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｍｉｎａｌ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ．Ⅱ． Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ， ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｌａｔｅｒａｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｕｐｔａｋｅ ｗｈｅｎ ｎｉｔｒａｔｅ ｓｕｐｐｌｙ ｉｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｏ ｏｎｌｙ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，１９７５，２６（１）：７９－９０．

［１４］ 杨传平，刘桂丰，梁宏伟，等． 耐盐基因Ｂｅｔ－Ａ转化小黑杨的研究［Ｊ］． 林业科学，２００１，３７（６）：３４－３８．

［１５］ 徐晨曦，姜静，李俊涛，等． 几种抗生素对山新杨离体叶片不定芽再生的影响［Ｊ］． 东北林业大学学报，２００７，３５（１）：２８－３０．

［１６］ 王玉成，杨传平，姜静． 紫丁香、糖槭总ＲＮＡ的快速提取方法［Ｊ］． 东北林业大学学报， ２００１，２９（６）：９０－９１．

［１７］ ＡＵＳＵＢＥＬ Ｆ Ｍ， ＫＩＮＧＳＴＯＮ Ｒ Ｅ， ＳＥＩＤＭＡＮ Ｊ，ｅｔ ａｌ． 精编分子生物学实验指南［Ｍ］． 颜子颖，王海林译． 北京：科学出版社，２００５．

［１８］ 刘稳，李杨，高培基． 过氧化物酶研究进展［Ｊ］． 纤维素科学与技术，２０００，８（２）：５０－６４．

［１９］ 郭媖，郭旺珍，张天真． 两个陆地棉过氧化物酶ｃＤＮＡ的克隆和鉴定［Ｊ］． 作物学报，２００７，３３（６）：８９１－８９７．

［２０］ ＬＩＵ Ｇ， ＳＨＥＮＧ Ｘ， ＧＲＥＥＮＳＨＩＥＬＤＳ Ｄ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ－ａｔｔａｃｋｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２００５，１８（７）：７３０－７４１．

［２１］ ＰＡＲＫ Ｓ Ｙ， ＲＹＵ Ｓ Ｈ， ＪＡＮＧ Ｉ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｄｎａ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００４，２７１（３）：３３９－３４６．

［２２］ ＧＵＮＮＡＲ ＦＯＳＳＤＡＬ Ｃ， ＳＨＡＲＭＡ Ｐ， Ｌ ＮＮＥＢＯＲＧ Ａ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｎｉｆｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｃａｌ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｐｏｎ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１，４７（３）：４２３－４３５．

［２３］ ＫＩＭ Ｙ Ｈ， ＫＩＭ Ｃ Ｙ， ＳＯＮＧ Ｗ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｓｗｐａ４ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ， ２００８，２２７（４）：８６７－８８１．

（责任编辑向闱）

收稿日期：２０１１－０８－１２

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（１１５５１３１８）；黑龙江八一农垦大学博士启动基金（Ｂ２０１０－５）

作者简介：郭晓红（１９８０－），女，黑龙江宁安人，讲师，博士，主要从事植物分子生物学研究，（电子信箱）ｄｏｎｇｊｉｎｇｃｈｅｎｇ２００２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；

通讯作者，吕艳东，副研究员，博士，主要从事植物基因工程及水稻节水灌溉研究，（电子信箱）ｌｕｙａｎｄｏｎｇ３３６＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。