心肌营养素—1在急性肝衰竭大鼠中的动态变化

潘珍珍　陈永平　潘陈为

[摘要] 目的 观察心肌营养素-1（CT-1）在急性肝衰竭大鼠中的动态变化及意义探讨。 方法 大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖（D-Gal）建立急性肝衰竭模型，在造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h分别留取肝组织，用RT-PCR法检测肝脏CT-1mRNA的表达，并用免疫组织化学方法检测环氧化酶-2（COX-2）蛋白的表达。 结果 CT-1在正常大鼠中表达很少，造模后12 h开始表达增多（P < 0.05），于48 h时达高峰值，随后逐渐下降； COX-2在正常组未见蛋白表达，造模后6 h表达量逐渐增多，至48～72 h时达高峰。 结论 CT-1参与了D-Gal诱导的肝衰竭模型的发生发展，有可能为急性肝衰竭的治疗提供一个新的治疗靶点。

[关键词] 心肌营养素-1；急性肝衰竭；环氧化酶-2

[中图分类号] R575[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）32-0001-03

心肌营养素-1（cardiotrophin-1，CT-1）是Pennica D等[1]于1995年发现的IL-6家族新成员，它具有广泛的生物活性。最近的研究发现，CT-1 在多种肝损伤的动物模型中发挥着较好的保护作用，促进肝细胞再生作用。急性肝衰竭（acute liver failure， ALF）是由于肝细胞大量坏死而导致肝功能严重受损为特征的综合征，因此如何减少肝细胞的凋亡和坏死、促进残存肝细胞再生，是改善急性肝衰竭患者预后的重要因素。本实验通过建立急性肝衰竭大鼠模型，采用半定量逆转录聚合酶反应法（RT-PCR）检测肝组织中CT-1的表达，并结合肝功能、COX-2的相应变化以探讨CT-1在急性肝衰竭中的作用。

1 材料和方法

1.1 药品及试剂

RT-PCR试剂盒（晶美生物公司），引物由上海基康公司合成，二步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司产品，PV-6001），COX-2单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZA-0515），D-Gal（重庆医科大学生物工程研究室，批号20041018）。

1.2 动物模型及分组

雄性SD大鼠，48只，体重200 g左右（温州医学院动物中心提供），用随机数字表将大鼠分成2组。A组（肝衰竭模型组42只）：将10%的D-氨基半乳糖按1.4 g/kg剂量腹腔注射，建立肝衰竭模型。分别于造模后的6、12、24、48、72、120、168 h 7个时间点各处死6只大鼠，取血及肝组织。B组（正常对照组6只）：按1.4 g/kg剂量生理盐水腹腔内注射，记为0 h，取血及肝组织。

1.3 肝功能检测

采用全自动生化分析仪检测ALT、AST水平。

1.4 COX-2蛋白表达的检测及HE染色

用10%中性甲醛固定的肝组织，石蜡包埋，4 μm病理切片，按说明书进行免疫组化染色及HE染色，COX-2免疫组化结果使用美国IPP5.0（Image Pro-plus 5.0）专业图像分析软件测定平均光密度值，用阳性部位的光密度值减去背景的光密度值，即为阳性部位的吸光度值。

1.5 CT-1mRNA表达的检测

按Trizol试剂盒说明提取RNA，用半定量RT-PCR测定肝组织CT-1mRNA的表达。三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参。GAPDH引物：上游 5'-ACCACAGTCCATGCCAT-3'，下游：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，产物452bp。CT-1引物：上游5'-GCCAAGATCCGACAGACAC -3'，下游：5'- GC ACAGCATCCAATAGCG-3'，产物241bp。PCR扩增参数：95℃5 min；94℃ 30 s；56℃ 45 s；72℃ 40 s；35个循环；72℃ 7 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并用100bp Ladder Marker 作分子量标准，在凝胶成像系统显像，用Gel-Pro 3.1软件半定量分析不同时相CT-1/GAPDH灰度比值。

1.6 统计学分析

采用SPSS11.5软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齐性者两两比较采用LSD-T法，方差不齐者进行Dunnets T3法。P < 0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能ALT、AST水平变化

肝衰竭模型组大鼠ALT、AST造模后6 h就开始上升（P < 0.05），于48～72 h达高峰值，此后逐渐下降。见表1。

2.2 HE染色结果

正常对照组肝组织肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。肝衰竭模型组在造模后24～48 h发现肝细胞广泛坏死，肝索解离，肝小叶结构破坏，残存肝细胞发生不同程度的水肿变性，中央静脉汇管区及坏死区有巨噬细胞和淋巴细胞为主的炎细胞浸润。见图1、图2。

2.3 COX-2蛋白的检测结果

正常对照组未见COX-2蛋白表达，肝衰竭模型组在造模后6 h表达量逐渐增多（P < 0.05），至48～72 h时达高峰，较24 h有明显增多，以中央静脉汇管区及坏死区周围表达最为明显。见表2、图3、图4。

2.4 CT-lmRNA的检测结果

正常大鼠肝细胞中CT-1mRNA表达很少，肝衰竭模型组在造模后12 h开始明显增多，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05），于48 h时达高峰值，随后逐渐下降。见表2，图5。

3 讨论

急性肝衰竭（ALF）是肝细胞广泛变性、坏死引起肝功能严重损害的临床综合征，病死率极高，因此成功建立急性肝衰竭动物模型是研究ALF的基本条件。在本实验中，通过腹腔注射1.4 g/kgD-氨基半乳糖诱导急性肝衰竭大鼠，结合肝功能ALT、AST变化及HE染色结果，说明ALF模型的成功建立。

目前的研究发现，CT-1在多种肝损伤的动物模型中发挥着较好的保护作用，但国内外尚无关于CT-1在D-氨基半乳糖诱导的ALF动物肝组织中的动态表达。本实验中，通过动态观察大鼠肝组织中CT-1mRNA的变化，结果发现肝衰竭模型组CT-1的变化趋势与AST、ALT相同，表明了CT-1参与了D-氨基半乳糖诱导的肝衰竭模型的发生发展。本实验结果显示CT-1mRNA在正常组表达很少，肝衰竭模型组在造模后12 h开始增多，于48 h时达高峰值，在168h仍高于正常对照组。这与Bustos M等[2]研究的肝再生模型中的表现稍有区别，后者是通过肝大部分切除构建肝衰竭，CT-1表现为造模后24 h达到高峰，于144 h回到基础水平，这可能同两种建模方法所致的肝衰竭机制不同有关。Inguez M等[3]研究发现在肝脏缺血再灌注损伤中，缺血损伤可见CT-1表达，随肝细胞损伤程度加重而表达增多，并且非缺血部位其表达更加明显。同时实验前预先静脉注射CT-1，可以抑制缺血再灌注造成的肝损伤，这提示内源性与外源性CT-1均具有明显的肝脏保护作用。CT-1基因敲除小鼠肝脏更容易遭受Fas因素诱导的凋亡打击。外源性CT-1对刀豆蛋白A诱导的大鼠和小鼠肝炎模型有良好的保护作用[4]。但目前CT-1保护肝细胞的机制尚不十分清楚。

环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是催化花生四烯酸转化为重要活性物质前列腺素初始步骤的关键限速酶。最近的一些研究显示COX-2在炎症的开始和治疗阶段均有作用。Tsukada 等发现COX-2在肝表达，并且在肝损伤时上调，同时使用选择性COX-2抑制剂，可使肝损伤加重[5]。国外有报道在临床使用非类固醇类抗炎药抑制COX-2活性和前列腺素的产生从而导致了肝损伤。本实验免疫组化结果表明正常对照组未见COX-2蛋白表达，造模后6 h表达量逐渐增多，至48～72 h时达高峰，以中央静脉汇管区及坏死区周围表达最为明显。并且结果发现COX-2与CT-1的变化趋势相一致，并略早于CT-1的升高，这提示了可能与COX-2刺激CT-1表达有关。Beraza等[6]研究也证明了COX-2与肝细胞再生之间以及与CT-1之间的联系，并指出肝部分切除不久后COX-2的激活和前列腺素的产生是对于肝增殖及CT-1的正确诱导是必须的。

本实验研究表明CT-1参与了急性肝衰竭大鼠的发生发展，可能参与肝脏再生作用，有可能为急性肝衰竭的治疗提供一个新的治疗靶点，但有关其具体机制，尚需进一步探讨。

[参考文献]

[1]Pennica D，King KL，Shaw KJ，et al. Expression cloning of cardiotropin-1，a cytokine that induces cardiac myocyte hypertrophy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（4）：1142-1146.

[2]Bustos M，Beraza N，Lasarte JJ， et al. Protection against liver damage by cardiotrophin-1：a hepatocyte survival factor up-regulated in the regenerating liver in rats[J]. Gastroenterology，2003，125（1）：192-201.

[3]Inguez M，Martinez-Anso E，Beraza N，et al. Cardiotrophin-1 efficiently protects the liver against ischemia-reperfusion （I/R）injury[J]. Journal of Hepatology，2004，40（1）：48.

[4]Marques JM，Belza I，Holtmann B，et al. CardiotroPhin-1 is an Essential faetor in the natural defense of the liver against apoptosis[J]. Hepatology， 2007，45（3）：639-648.

[5]Tsukada K，Hasegawa T，Tsutsumi S，et al. Roles of cyclooxygenase-2 in tissue injury during hemorrhagic shock[J]. Shock，2000，13（5）：392-397.

[6]Beraza，Margués JM，Martínez-Ansó E，et al. Interplay among gardiotrophin-1，prostaglandins，and vascular endothelial growth factor in rat Liver regeneration[J]. Hpatology，2005，41（3）：460-469.

（收稿日期：2012-09-03）