BHK21细胞在新型微载体培养系统生长条件优化

王进产 焦金波 何翠 张海洋 乔荣岑 白朝勇 孙进忠

摘 要：目的：使用BelloCell-500AP生物反应器和BioNOC?-II 微载体，对BHK21细胞在此新型高密度培养生物反应器中的生长特性进行研究。方法：首先将1.5×108个BHK21细胞悬液加入含有微载体的生物反应器内，按生物反应器厂家推荐参数进行培养，每天取载体计数观察BHK21的生长特性。然后调整细胞浓度和微载体培养系统运行参数。结果：BHK21细胞经过6 d培养载体中细胞总数达到峰值，细胞密度是起始接入数量的31倍为4.41×109个；经过培养过程参数优化，确定适于BHK21细胞高密度培养参数。试验成功实现了BHK21细胞的高密度培养，为以BHK21细胞为生产基质的病毒疫苗生产提供了一条简便快捷的途径。

关键词：生物反应器 微载体 BHK21细胞

中图分类号：S852．659 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）12（b）-00-02

目前我国兽医生物制品生产过程中，细胞培养设备相对比较落后，大多是在转瓶内旋转贴壁培养，不仅劳动强度大、操作复杂、容易造成污染，还经常出现细胞贴壁不均造成不同批次细胞的差异。为了提高产量，只有通过增加培养转瓶数，而这往往受到生产场地的限制，而生物反应器就弥补了这些不足。BelloCell-500AP是美国Cesco公司研发的一种能有效地使细胞内外营养和气体交换的新型固定床式生物反应器。在国内外该生物反应器已经广泛应用于HEK 293、Vero、CHO、SF-9、ST等多种哺乳动物细胞和昆虫细胞的培养[1-8]。BHK21细胞广泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒等病毒疫苗的生产基质，BHK21细胞在纯悬浮培养系统和搅拌式微载体培养系统的报道比较多。本研究使用新型潮汐式固定床微载体培养系统BelloCell-500AP和BioNOC -II 片状微载体对BHK21在微载体生长特性进行研究，探索细胞增殖规律，为口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒在这一新型反应器培养工艺研究作铺垫。

1 材料与方法

1.1 试验材料

BHK21细胞（中国兽医药品监察所），DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（PAA），葡萄糖（Sigma），BelloCell-500AP高密度细胞培养系统（CESCO）

1.2 试验方法

1.2.1 微载体培养BHK21细胞方法（1）细胞的接种后贴壁阶段将长满单层BHK21细胞转瓶消化后计数，取1.5×108颗细胞于30 mL培养基内备用，将470 mL含5% FBS的DMEM倒入BelloCell-500AP中，然后将准备好的BHK21细胞均匀地加入载体上，然后置于BelloStage机器，启动吸附程序。

（2）细胞的接种后培养阶段 吸附结束后启动培养程序，24 h后无菌条件下将载体瓶与2 L储液罐连接，启动换液程序。

1.2.2 细胞在微载体培养过程的培养参数的检测

（1）细胞核染色计数

从BelloCell-500AP取6片载体分装于3个含CVD（结晶紫、Triton X-100、EDTA）的1.5 mL EP管中，每管分装2片。震荡1 min后，将其置于37 ℃孵育，每隔15～20 min震荡1次，60 min后取出PBS作2～50倍稀释，取10 μL于细胞计数板加样孔进行计数，计算3个EP管中载体上的细胞总数，然后计算出每片载体片上的细胞数，根据Bellocell-500含有载体数（约865±5片）计算1个载体瓶所细胞总数。

（2）细胞状态和生长密度

从BelloCell-500AP取含有细胞的载体片放入已含95%酒精的1.5 mL离心管中浸泡5 min，将细胞脱水并固定，弃去95%酒精并以PBS洗涤一次，然后加入H&E（Hematoxylin）染色剂染10 min用超纯水冲洗，将载体置于显微镜下观察细胞在微载体成长状态和密度。

（3）培养过程中pH值

无菌条件下分别从BelloCell-500AP和2 L储液罐取出少量液体，酸度计测定其pH值，根据pH值的高低分析细胞增殖对培养基酸碱度的影响，进而根据pH变化决定试验结束时间。

1.3 细胞在微载体培养过程中培养条件的优化

1.3.1 细胞接种数量对微载体培养系统下BHK21细胞生长特性的影响细胞接种浓度分别为：（1）1×108个/500 mL，（2）1.5×108个/500 mL），（3）3×108个/500 mL，其他培养参数同1.2.3中步骤，观察细胞接种密度对细胞增殖特性的影响。

1.3.2 微载体培养系统运行参数对BHK21细胞贴壁的影响微载体培养系统细胞贴壁阶段运行时分别于细胞接种后2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h取出6片载体按1.3.1中的方法对载体中细胞进行计数，根据载体中细胞数和接入的细胞总数，计算不同贴壁时间细胞与载体的吸附情况。

1.3.3 微载体培养系统运行参数对BHK21细胞增殖特性的影响

（1）培养液流速对细胞增殖的影响 微载体培养系统细胞培养阶段，培养液流动速率分别设定为1 mm/s、2 mm/s、4 mm/s，其他培养参数同1.2.3中步骤，观察细胞接种密度对细胞增殖特性的影响。

（2）顶部停留时间对细胞增殖的影响 微载体培养系统细胞培养阶段，液体在载体罐（BelloCell-500AP）顶部停留时间分别为0 s、10 s和30 s，其他培养参数同1.2.3中步骤，观察其对细胞增殖的影响。

2 结果与讨论

2.1 不同培养时间细胞染色观察

不同培养时间的载体片经固定和H&E（Hematoxylin）染色后发现细胞接种后24 h在载体纤维状的基质上有少量散在细胞，并在培养初期（0～96 h）绝大部分细胞是沿着基质增殖的，到96 h细胞已经铺满整个基质见图1A （94 h），随后细胞增殖主要发生在载体基质与基质之间，并在144 h细胞已铺满整个载体，见图1的B。

2.2 BHK21细胞在BelloCell-500AP中生长特性

BelloCell -500AP起始细胞接种量为1.5×108，经过6 d培养，BelloCell-500AP载体内细胞数通过CVD细胞核染色计数达最高细胞密度是起始密度的31.73倍。细胞接入24 h内细胞增殖较慢，在细胞接种后24～96 h细胞进入快速增殖期。细胞接入接种96 h时载体内细胞总数为3.28×109，是起始密度的23.60倍。随后细胞增殖放缓，细胞培养120 h时载体上细胞总数仅为96 h的1.26倍，细胞培养144 h载体上的细胞数为120 h的1.07倍。由于此时载体瓶中的pH值已经降至7.0以下，试验结束。

2.3 细胞接种密度对细胞生长特性的影响

在生物反应器培养固定化细胞的培养过程中，所接种细胞量亦是影响所培养细胞生长浓度的关键影响因素，探讨片状载体材料用于培养BHK21细胞时细胞承载量，贴附于固定化载体材料上细胞密度的多寡，亦是之后细胞大量复制生长浓度高低的重要因素。在此试验中设计了3组不同细胞接种浓度在生物反应器生长曲线见图2所示。

图2 不同细胞接种量对BHK21细胞生长的

影响

由图可以看以第2组和第3组生长曲线比较接近，两者在经过144 h培养后发现两则的细胞数依然很接近，分别为，42.24×108和44.14×108颗细胞。而接种密度最低的第1组培养144h的细胞总数仅为32.47×108，远低于另两组。细胞接种数量少，细胞种准备相对容易，因此细胞接种密度为1.5×108个/500 mL时，更适于BHK21细胞在微载体培养系统增值。

2.4 细胞贴壁程序运行时间对BHK21细胞贴壁的影响

BHK21细胞在载体表面上增殖生长主要可以分为贴壁、生长与扩展成单层三个阶段 ，其中哺乳动物细胞贴壁阶段是决定细胞是否得以大量复制生长的关键。在本试验设定的5贴壁程序运行时间，时间越长吸附到载体上的细胞数也越多，但到细胞贴壁阶段运行3.5 h和4 h，细胞与载体的吸附率差异很小，两者的贴附效率为92%和93%。为缩短细胞培养时间，选择3.5 h贴壁程序运行时间更为合适。

2.5 微载体培养过程中培养液流速对BHK21细胞增殖的影响

培养基流速大小是造成细胞培养系统生物反应器剪切力大小的关键因素，本试验在微载体培养时使用3种不同培养液液流速，在接种密度均为1.5×108个BHK21细胞的生长曲线见图3。

图3 不同培养液流速对细胞增殖的影响

由图可以看出，不同培养液流速对细胞培养早期（0-72 h）细胞生长速度影响很小。培养液流速1 mm/s和2 mm/s的载微载体生物反应器在细胞培养72 h计数算细胞总数分别为23.7×108个/500 mL和23.4×108个/500 mL，培养液流速为4 mm/s载体瓶中算得的细胞略低，为20.7×108个/500 mL。72 h后不同培养液流速对细胞增殖的影响增加，培养基流速为4 mm/s的载体瓶细胞增殖变缓。培养基流速为2 mm/s的载体瓶中在培养144 h计算出的细胞总数略多于培养基流速为1 mm/s的载体瓶，前者最大细胞密度为46.5×108/500 mL，而培养液流速为1 mm/s条件下BHK21的峰值为43.4×108/500 mL。因此、培养BHK21细胞在微载体生物反应器培养时培养液流速为2 mm/s更合适。

2.6 微载体培养过程中培养液在载体瓶顶部停留时间对BHK21细胞增殖的影响

设计了3组分别为（1）0 s、（2）10 s和（3）30 s 不同顶部停留时间来进行试验。当培养液在BelloCell-500AP顶部停留时，载体完全没培养液下方，贴附于载体上 BHK21细胞能充分吸收培养液中的养分，但在同时BHK21细胞确无法获得足够的氧气且代谢物停留也会影响细胞生长，因此培养液在BelloCell-500AP顶部停留时间的长短也是影响细胞生长的重要因素之一。本试验设定微载体培养系统不同顶部停留时间对BHK21细胞生长影响的试验结果

见图4。

图4 不同培养液停留时间

对细胞增殖的影响

根据图4可看出，营养液顶部停留时间为0 s和10 s时细胞增殖曲线比较接近。但后者培养144 h具有更大的细胞密度为42.77×108个/500 mL。顶部停留时间为30s时，在培养初期（72 h前）细胞生长的速度比另两组快，但72 h后生长速率明显放缓，并且培养144 h最大细胞数为37.53×108个/500 mL。因此，培养液停留10 s时 细胞表现出教佳生长速度。

参考文献

[1] Ho L，Greene CL，Schmidt AW，and et al.Cultivation of HEK 293 cell line and production of a member of the superfamily of G-protein coupled receptors for drug discovery applications using a highly efficient novel bioreactor）[J].Cytotechnology，2004.

[2] 郑云程，吴建虹，孙奋勇，等.利用一种新型反应器—BelloCcll培养动物细胞[J].生物学杂志，2010.

[3] 马良，田宇婧，周建民，等.采用潮汐式生物反应器进行ST细胞培养的研究[J]. 中国农学通报，2012.