异体复合组织移植皮肤淋巴引流隔绝动物模型的建立

刘沙,裴蛟淼,李杨,曹姣,杨阳,李冰,夏炜,郭树忠

[摘要]目的：通过SD大鼠下腹部游离皮瓣及皮管的移植，建立大鼠异体复合组织移植皮肤淋巴引流隔绝模型。方法：7～8周龄雄性SD大鼠切取下腹部皮瓣并游离行同种异体移植，皮肤隔离组（A组）：将供体皮瓣边缘对合、缝合成管状，底边留血管蒂出口用隔离器隔离皮肤，显微外科吻合血管，皮管缝合于隔离器，隔离器固定于受体；皮肤未隔离组（B组）：将供体游离皮瓣卷制成管状，显微外科吻合血管并将供受体皮肤对位缝合；空白对照组（C组）：行下腹部游离皮瓣异体移植。大体观察每组皮瓣或皮管存活时间，于术后3、5、7、14、28、35d取移植物皮肤组织行HE染色,观察病理学变化。结果：A组：皮管存活时间为32（34，32）天；B组：皮管存活时间为15（16,15）天；C组：皮瓣存活时间为6（7,6）天。A组与C组、B组与C组、A组与B组存活率差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：本实验成功建立了大鼠的异体复合组织移植淋巴引流隔绝模型,并证实了隔绝皮肤淋巴引流能有效延长移植物的存活时间。

[关键词]异体复合组织移植；免疫抑制；动物模型；淋巴引流

[中图分类号]R332[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）04-0589-04

The establishing of composite tissue allograft skin lymphatic vessels isolation animal model in rats

LIU Sha,PEI Jiao-miao,LI Yang, CAO Jiao,YANG Yang，LI Bing，XIA Wei, GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo establish lymphatic vessels isolation animal model through vascularized hypogastric flap between SD rats.Methods18 couples of SD rats(7-8weeks) were randomly divided into 3 groups. Group A(skin lymphatic vessles isolation): The free tube made of vascularized free flap located on the surface of the recipient through the isolation device after vascular anastomosis. Group B(tube) : The free tube made of vascularized free flap sutured on the recipient lower abdomen directly after vascular anastomosis. Group C(control) free flap allotransplantation. Observe the survive ratio of animal and rejection time of composite tissue flap, histologic outcomes on the day 3,5,7,14,28, and 35 after transplantation. ResultsThe survival times of grafts in group A are 32（34, 32）days and group B were 15（16,15）days. By contrast,the survival time of group C was 6（7,6）days. The difference among these three groups were significant. ConclusionsThis experiment successfully established lymphatic vessels isolation animal model in SD rats. The prolonged survival times of the grafts in this animal model had been proved.

Key words: composite tissue allotransplantation；immunosuppression；animal model; lymph draining

器官移植已成功应用于临床50多年，然而异体复合组织移植却仍处于研究阶段，难以在临床上推广应用。皮肤的强抗原性和缺少有效安全的免疫抑制方案成为限制异体复合组织移植发展的主要因素[1-2]。探索皮肤强抗原性的机制，并通过寻找靶点进行干预，来降低机体对异体皮肤移植物的免疫排斥成为研究热点[2]。血液循环系统及淋巴引流系统是机体排斥同种异体移植物的重要组织结构，然而哪个更为重要仍存在争议[3]。在异体皮肤及角膜的移植研究中，证实引流淋巴结及淋巴引流至关重要，对切除引流淋巴结的豚鼠进行相应引流部位的异体皮肤移植后，异体皮肤存活时间延长[4]，角膜的Langerhans等骨髓来源的细胞[5-6]在移植后可以迁移至局部引流淋巴结，提呈角膜的异体抗原，引发免疫排斥反应[7]，因此阻断异体复合组织移植物的皮肤淋巴引流与受体相接触，有效的切断移植物中的抗原提呈细胞通过淋巴管引流至引流淋巴结，从而阻止其激活T细胞，无法启动免疫排斥反应，进而可能诱导免疫耐受，延长移植物的存活时间。本实验拟建立大鼠下腹部异体复合组织移植皮肤淋巴引流隔绝模型，该模型的异体移植物仅有血液循环系统而无淋巴引流系统，通过观察移植物的存活情况来评估淋巴引流系统对启动移植排斥的重要性。

1材料和方法

1.1 实验动物与分组：随机选取清洁级体重280～300g SD雄性大鼠36只（供受体各18只），由第四军医大学实验动物中心提供；实验分组：随机分为3组，A组（淋巴隔离组，n=6）：将供体皮瓣边缘对合后缝合为管状并用隔离器隔离，显微外科吻合血管，皮管缝合固定于隔离器内，隔离器缝合固定于受体；B组（淋巴未隔离组，n=6）：将供体游离皮瓣边缘对合后缝合为管状，显微外科吻合血管并将皮管直接缝合于受体；C组（对照组，n=6）：行下腹部游离皮瓣异体移植。

1.2 实验设备与材料：手术显微镜（Leica M651）,显微手术器械（上海众合天工医疗器械有限公司），自制隔离器，甲醛(天津天峰化学药品有限公司)，戊巴比妥钠（佛山市实验化工厂），显微镜（Nikon Eclipse 55i）。

1.3 动物模型的建立

1.3.1 隔离器的制作：选取直径为3.5cm高2cm的圆形塑料盖子，在塑料盖侧边和内缘处标记六个等分点，在标记处打直径约3mm圆孔，在侧边各圆孔连线中点用钢锯切割至內缘处，消毒灭菌（见图1、2）。

1.3.2 隔绝动物模型的制作

1.3.2.1供体手术：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为50mg/kg，术中必要时追加1/3量。剃除下腹及后肢毛发，消毒、铺单后在股动脉搏动点上方设计一大小为4cm×4cm的皮瓣，切开皮肤及皮下肉膜层，暴露出股动静脉血管束及其分支腹壁浅动静脉，皮瓣四周游离后折叠成皮管并缝合皮肤，给血管蒂入口留出足够空间避免血管蒂受压。显微镜下游离出大鼠股动静脉，结扎其分支并仔细剥除血管旁膜以备吻合血管，于腹壁浅动静脉分支处结扎股动静脉分支，血管夹分别夹闭股动静脉，显微剪在股动静脉已剥除血管旁膜部位剪断血管，游离皮管肝素化。

1.3.2.2 受体手术：麻醉、消毒、铺单同供体，在腹股沟处标记一三角形区域，切开皮肤及皮下组织，充分暴露股动静脉，显微镜下分离并剥除待吻合处血管外膜，远端11-0尼龙线结扎，近端血管夹夹闭，显微剪于待吻合处剪断血管，肝素冲洗待吻合血管。

1.3.2.3 吻合手术：将皮管原位置于受区，11-0尼龙线吻合动静脉。

1.3.2.4 安装隔离器：血管吻合完毕后，将皮管放置于已消毒的隔离器中，血管蒂通过隔离器内孔并且不受周围组织及隔离装置的挤压，将皮管通过内缘圆孔用1号线缝合于隔离器上，将缝线收紧并打结，使供瓣皮缘仅与隔离器接触，同时隔离器也通过内缘圆孔缝合固定于受鼠体表,受鼠皮缘也仅与隔离器接触，使得皮管以类似于帐篷样支撑于隔离器上，供、受体之间仅通过血管蒂连接，从而将移植物通过隔离器牢靠地固定于受区并保证双方皮肤不发生接触。将细铁丝网按隔离器外缘大小剪成圆形，边缘用医用胶布粘贴，并将其通过固定器的侧边圆孔1号线固定（见图1）。此步骤目的在于保证移植物皮肤不与受体接触的前提下血管蒂不受挤压，皮瓣不被受体鼠啃咬。

1.4观察及检测指标

1.4.1 观察皮瓣的大体生存情况及存活天数，皮肤色泽、质地、有无渗出，并做记录，绘制生存曲线。

1.4.2 病理切片观察：术后第3、5、7、14、28、35天取移植物皮肤组织1cm2，即刻浸泡于10%甲醛溶液24h，石蜡包埋、切片，HE染色。

1.5 统计学处理：本实验数据均在统计教研室的指导下，应用spss16.0统计软件完成。绘制Kaplan-Meier生存曲线，各组生存时间用中位数（M）和四分位数（Q25，Q75）表示，采用Log Rank对各组生存曲线分布是否相同进行检验，P＜0.05，各组存活天数差异具有统计学意义。

2结果

2.1 隔离装置：所制淋巴隔离器能够有效的阻止供体皮瓣与受体皮肤之间的淋巴引流网形成，并且保护了血管蒂不受挤压，而且将移植皮瓣固定于受体大鼠下腹部的同时能够避免被啃食或拖拽发生坏死（见图2）。

2.2 各组移植物的生存情况及生存曲线：各组存活情况见图3～5。A组皮管的存活时间分别为33、32、30、38、35、34天；B组皮管的存活时间分别为14、14、16、15、15、17天；C组皮瓣的生存时间分别为5、6、6、7、8、7天。

各组生存时间中位数与四分位数值分别为：A组32（34,32），B组15（16,15），C组6（7,6），生存曲线见图6。

2.3 各组移植物HE染色结果：术后第7、14、35天染色结果分别见图7～9。

3讨论

3.1 同种异体复合组织移植的应用为整形与重建外科移植领域的发展提供了非常广阔的空间，解决了以往拆东墙补西强的弊端[8]，虽然显微手术技术方面已趋于成熟，各种新型治疗方法如细胞治疗[9]、单克隆抗体干预[9-11]、诱导嵌合体耐受[12]等手段不断问世，但临床上仍以免疫抑制药物为主，其预防性用药以及发生排斥反应时的大剂量冲击治疗所带来的毒副作用给患者带来了很大的痛苦，不仅经济上付出沉重的代价，更面临发生危及生命并发症的可能。本实验的目的在于通过建立皮肤淋巴隔绝的异体复合组织移植动物模型，来验证淋巴引流系统在异体复合组织移植中对启动排斥反应的重要性，为进一步研究淋巴引流系统启动排斥反应的作用机制提供方法、建立研究基础。

3.2 皮肤真皮层及真皮下层含有广泛且丰富的淋巴引流网，这可能是导致人体皮肤免疫原性最强的重要因素，并且真皮下淋巴网具有很强的重建能力[4]。异体复合组织移植后供受体之间淋巴引流的重建可能是启动免疫排斥反应的主要原因。因此，本实验创新点在于成功建立了同种异体复合组织移植的皮肤淋巴引流隔绝大鼠模型，在不使用任何免疫抑制药物的情况下有效延长了移植物的存活时间，验证了隔绝皮肤淋巴引流可以有效的阻止或延缓排斥反应的发生。隔绝淋巴组移植物最终发生了排斥，排斥发生时均可以发现供受体皮肤通过不断生长已发生接触，因此排斥的发生可能是因为皮肤最终发生接触后，重建了淋巴引流，启动了排斥反应。下一步的研究应设法持续阻断供受体皮肤的接触，观察是否能继续维持免疫耐受状态，并检测参与细胞的不同，分析、比较淋巴管重建前后大鼠免疫状态的区别以及排斥反应发生情况。

3.3 本实验淋巴隔绝组皮瓣存活超过30天后，供体皮瓣血管蒂出口处和受体下腹部供体血管蒂入口处的表皮挛缩并向心性生长，可能导致血管蒂受压使皮瓣缺血性坏死，在后期研究中需进一步验证。在动物模型的建立中我们还发现，在保证供、受体之间皮肤不接触的同时避免感染是一个难题，避免感染一方面要做到严格的无菌操作，另一方面就是尽可能的缩小血管蒂部的开口，但是血管蒂部位的开口又不可以太小，否则在术后皮瓣的肿胀期中会导致血管受压发生血供障碍致移植物坏死，避免感染与保证血管蒂不受挤压之间寻求平衡是此动物模型成功与否的关键。

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-13

编辑/张惠娟