带菌嫁接工具对西瓜嫁接苗BFB发生的影响及防治方法

牛庆伟 孔秋生 黄远 别之龙

摘 要： 细菌性果斑病（BFB）是西瓜上的毁灭性病害，西瓜嫁接苗集约化生产过程中容易感染该病害，研究嫁接过程中BFB的侵染途径及防治方法对于西瓜健康种苗生产具有重要意义。本研究通过人工模拟接种西瓜细菌性果斑病菌pslbtw20，分析了用带菌竹签嫁接对西瓜嫁接苗BFB发生的影响，同时研究了不同消毒技术的效果。结果表明，高浓度菌源污染的竹签嫁接能够导致嫁接苗BFB的发生，嫁接前采用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡带菌嫁接用具15 min，防效可达到100%。

关键词： 嫁接工具； 竹签； 细菌性果斑病； 消毒技术； 西瓜嫁接苗

西瓜细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch）是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli）引起的瓜类细菌性果腐病，简称BFB，是典型的由种子带菌引起的传染性病害，也是我国规定的检疫性病害之一。BFB从苗期到成株期均可发生，病菌可危害瓜类植物的叶子和果实，引起叶枯和瓜腐，但叶柄、茎、根不受浸染[1]。BFB病菌主要附着在种子和病株残体上越冬，种子带菌为主要侵染来源，病菌随风、雨或灌溉水从植株气孔或伤口侵入，在病株上大量繁殖扩展， 造成再次侵染[2]。

BFB于1985年在我国首次被发现，目前该病在我国各西瓜产区均有发生。随着西瓜集约化嫁接育苗技术的普及，越来越多的育苗工厂开始出现BFB的发生与流行。BFB对嫁接苗会造成毁灭性的危害，其所造成的损失和影响远比其他瓜类病害严重。因此，研究嫁接苗生产过程中BFB的侵染途径及其防治方法，对保护瓜农、育苗生产者的利益和防控西瓜BFB的发生与流行具有重要意义。

嫁接过程中嫁接苗的伤口、污染的刀具和器皿及人为的传播均会造成病害的流行[3]。Bahar等[4]发现在甜瓜1叶1心期，茎部人工针刺接种BFB病菌，会导致甜瓜幼苗发生BFB，最终腐烂死亡。在西瓜嫁接过程中，需使用竹签等嫁接工具在砧木上斜插，这也相当于一个接种过程。然而，如果竹签等嫁接工具带有病原菌，会不会造成嫁接苗BFB的发生，目前尚不知晓。本研究的主要目的是利用人工接种的方法，分析用带菌竹签嫁接与西瓜嫁接苗BFB发生的关系，寻找高效嫁接用具消毒技术，旨在为西瓜嫁接苗健康生产提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

砧木和接穗分别选用京欣砧1号（北京京研益农科技发展中心提供）和早佳（84-24，新疆明鑫科鸿农业科技有限责任公司提供）。 西瓜细菌性果斑病菌为pslbtw20，由中国农业科学院植物保护研究所赵廷昌研究员惠赠。供试培养基为KBA培养基（硫酸镁1.5 g、磷酸氢二钾1.5 g、琼脂20 g、甘油10 g、蛋白胨20 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.0～7.2）。嫁接竹签由武汉洪北种苗有限公司提供。试验于2012年3月15日至5月1日在华中农业大学校内进行。

1.2 试验方法

1.2.1 药剂室内抑菌和杀菌试验 挑选西瓜细菌性果斑病菌pslbtw20的单菌落，在KBA液体培养基中28 ℃、220 r·min-1培养，制成菌量约为108 cfu·mL-1的菌悬液。分别用40% 甲醛50倍液、75% 酒精进行西瓜细菌性果斑病菌的抑菌和杀菌试验。抑菌作用采用纸碟法进行测定[5]，杀菌效果测定按照赵廷昌的方法进行[6]，处理BFB病菌的时间分别为5、10、15 min。

1.2.2 竹签接菌浓度与西瓜嫁接苗BFB发生的关系 选用浓度为108、107、106、105、104 cfu·mL-1的菌悬液，采用人工蘸取菌悬液的方法对竹签接菌，无菌水为对照。嫁接方法均采用顶插接[7]，嫁接竹签蘸1次菌液嫁接1株西瓜苗，共6个处理，3次重复，每个重复18株。在温室中生长10 d，每天记录嫁接苗发病率，观察嫁接苗发病情况。

1.2.3 确定嫁接苗子叶期发病情况的分级标准 根据嫁接苗发病情况并参考Hopkins and Thompson[8]提出的1～9级分级标准，确定竹签带菌时嫁接苗子叶期发病情况分级标准，用于计算病情指数。

1.2.4 带菌竹签嫁接与西瓜嫁接苗BFB发生的关系 在育苗工厂的嫁接过程中，竹签需要连续嫁接作业，所以有必要模拟带菌竹签在育苗工厂中对嫁接苗的危害情况。选用108 cfu·mL-1左右的菌悬液，嫁接竹签蘸取菌液1次，然后按顺序连续嫁接50株西瓜苗（1个穴盘），重复3次，以不带菌嫁接竹签为对照。每天调查嫁接苗发病率并计算病情指数，病情指数参考Amadi等[9]的计算公式：

1.2.5 带菌竹签消毒技术对西瓜嫁接苗BFB的防治效果 选用108 cfu·mL-1左右的菌悬液，采用人工蘸取菌悬液的方法对竹签接菌，分别用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡15 min 消毒，消毒后按顺序连续嫁接50株西瓜苗，以带菌竹签嫁接处理作为对照，共3个处理，每个处理重复3次。第10天调查每株嫁接苗的病情指数和发病率。

2 结果与分析

2.1 2种消毒液对西瓜细菌性果斑病菌的室内抑菌和杀灭效果

室内应用圆形滤纸法测定结果表明，40% 甲醛50倍液对西瓜细菌性果斑病菌有显著抑菌作用，抑菌圈直径为16.6 mm，75% 酒精对西瓜细菌性果斑病菌无抑菌作用。室内杀菌试验结果表明，40% 甲醛50倍液和75% 酒精分别处理西瓜细菌性果斑病菌，无论是处理5、10 min，还是15 min，KBA固体培养都无单菌落存在，杀菌效果达到100%。

2.2 不同带菌浓度竹签嫁接对西瓜嫁接苗BFB发病率的影响

竹签不同带菌浓度下西瓜嫁接苗BFB发病率见图1。当嫁接竹签带菌浓度为104 cfu·mL-1时，西瓜嫁接苗在嫁接后 10 d内未发生BFB，与对照无差异；当带菌浓度为105 cfu·mL-1时，嫁接后第7 天开始发病，第10天发病率达到40.7%；当带菌浓度为106、107、108 cfu·mL-1时，嫁接苗在嫁接后第3天开始发病，第9天发病率达到100%。本试验结果表明，带菌竹签嫁接能够导致嫁接苗发生BFB，并且带菌浓度越高，病症出现的时间就越早，而且发病程度也越严重。

2.3 子叶期嫁接苗发病分级标准

2.4 带菌竹签连续嫁接对西瓜嫁接苗BFB发生的影响

带菌竹签连续嫁接50株西瓜苗，嫁接苗BFB发病率和病情指数的动态变化见图3。嫁接苗从第3 天开始发病，接穗子叶早期出现水渍状病斑，后期逐渐转变为褐色坏死病斑，接穗茎部出现褐色病斑条纹，病情严重的导致嫁接苗接穗腐烂枯死，病情指数和发病率随时间延长不断加重，第8天嫁接苗发病率达97.3%，第10天嫁接苗病情指数达到88.4，对照嫁接苗没有发病。

嫁接10 d后，采集2株接穗子叶有明显病斑的成活西瓜嫁接苗，嫁接苗病原菌分离结果见图4。不带菌浓度竹签嫁接处理，嫁接苗嫁接部位、接穗茎和接穗子叶未能分离得到单菌落，但是在发病嫁接苗的这3个部位均能够分离到单菌落，挑取疑似单菌落进行PCR检测，检测结果见图5。在16个PCR扩增产物中，15个能够扩增到BFB细菌的特异性片段，片段长度在250～500 bp，而2.5 竹签消毒技术对西瓜嫁接苗BFB的防治效果

带菌嫁接竹签不同消毒技术对西瓜嫁接苗BFB的防效见表1。带菌竹签嫁接50株西瓜苗，嫁接后第10天嫁接苗发病率为97.3%，病情指数 88.4，40%。采用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡带菌竹签15 min后嫁接西瓜苗，防效达到100%。可见，40% 甲醛50倍液或75% 酒精浸泡带菌竹签15 min能够有效防治竹签带菌所导致的嫁接苗染病，消毒效果彻底。

3 讨 论

BFB危害在我国各西瓜产区均有报道，西瓜嫁接育苗场感染BFB是造成毁灭性危害的形式之一[12]。接穗种子带菌是导致嫁接苗感染BFB的主要原因，通过集约化生产途径使得BFB得以发生蔓延。本研究结果表明，带菌竹签嫁接能够导致嫁接苗发生BFB，并且带菌浓度越高，病症出现的时间就越早，而且发病程度也越严重。采用带菌浓度为108 cfu·mL-1的竹签连续嫁接50株西瓜苗，嫁接苗发病率达97.3%，病情指数达88.4。可见，在嫁接苗集约化生产过程中，被高浓度菌源污染的嫁接竹签作为BFB病菌的传播者，能够导致嫁接苗BFB 发生，对西瓜嫁接苗危害极其严重，研究带菌嫁接工具对嫁接苗BFB发生的影响及其防治方法意义重大。

在嫁接苗BFB的发生与防治研究中，嫁接用具的消毒至关重要，韦志扬[13]曾指出，要严格消毒嫁接用具，嫁接的刀具和器皿嫁接前用40% 甲醛50倍液浸泡10 min以上，马凌珂等[14]指出嫁接用具需用75% 酒精溶液浸泡30 min，但是缺乏试验证明，目前尚未取得一致认可。本研究采用40%甲醛50倍液或75% 酒精浸泡带菌嫁接竹签15 min，消毒处理后嫁接苗BFB发病率为0，消毒效果彻底。

嫁接时带菌竹签对砧木的斜插相当于对嫁接苗嫁接部位人工接菌，嫁接部位的Aac如何侵染并导致嫁接苗发病，目前尚不知晓。前人研究结果表明，Aac有单根极生鞭毛，其鞭毛在侵染过程中有重要的作用，IV 型菌毛可帮助病菌定殖和在维管束导管中移动[15]，BFB病菌能够通过木质部导管向下和向上移动从而系统侵染甜瓜幼苗[4]。本研究结果表明，在发病嫁接苗的嫁接部位、接穗茎和接穗子叶中存在BFB病菌，接穗茎部出现褐色病斑条纹；由此推断，在嫁接部位的BFB病菌可能通过接穗茎部木质部导管侵染接穗子叶，BFB病菌可以系统侵染西瓜嫁接苗。

4 结 论

在西瓜嫁接苗的工厂化生产过程中，使用高浓度菌源污染的竹签嫁接能够导致西瓜嫁接苗BFB的发生，对嫁接苗的危害极其严重，采用40% 甲醛50倍液或75% 酒精浸泡带菌嫁接竹签15 min，对嫁接苗BFB防效达100%，消毒效果彻底。

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