使用UHPLC分析多肽和蛋白质选择更贴合应用的固定相以提高准确度

Phu Duong

安捷伦ZORBAX超高压快速高分离度（RRHD）宽孔径300A色谱柱是进行蛋白质级结构分析的最佳选择，能够有效进行蛋白质鉴定、翻译后修饰定量，在生物治疗用蛋白的研发及生产应用中还有助于获得杂质的指纹图谱。

现在，安捷伦又增加了多种新的ZORBAX色谱柱固定相，为广大用户提供更多的选择来优化整体结果。与安捷伦3.5μm和5μm300A色谱柱一样，新型C18、C8和C3色谱柱也使用StableBond固定相。此外，新型ZORBAX宽孔径300A二苯基固定相色谱柱使用安捷伦PursultXRs100A和200A色谱柱采用的二苯基固定相。

C18固定相采用反相填料，用于肽片段分析中的重要应用，例如从蛋白质酶解物到小分子蛋白质分析。C8固定相分析大分子蛋白质（包括抗体）时具有较高的分离度和回收率。C3固定相能够为较大分子疏水性蛋白质（包括单克隆抗体MAb）分离提供更多选择性和更好的峰形，回收率也更高。而二苯基固定相通过与MAb和芳香族氨基酸的pi-Pi相互作用为您带来更多选择性。

下图显示了安捷伦ZORBAXRRHD生物色谱柱系列的部分应用。图1-4显示了4种色谱柱在不到2分钟的时间里极好地分离了蛋白质和降解产物。C18和二苯基固定相的色谱图包含了色谱柱的选择性，图5对两者的性能进行了比较。与C18柱相比，二苯基柱的分离度更好。表1还列出了C18柱和二苯基柱的一些性能参数。

最大程度优化分析结果

将目光移向ZORBAX生物色谱柱系列，客户便可轻松找到最适合特定应用的色谱柱。该系列色谱柱采用久经验证的StableBond技术，该技术在低pH环境下具有良好的稳定性，使用三氟乙酸或甲酸流动相改性剂分离蛋白质和多肽时也能得到对称峰形，丝毫无损色谱柱寿命。在紫外和质谱检测下都能获得稳定的基线。这些新型色谱柱的柱效得到极大的提高，进一步改善了分离度，并且能够更可靠地定量翻译后修饰。

色谱柱的包装工艺也经过优化，用于安捷伦1290Infinity液相色谱时最高耐压1200bar。安捷伦ZORBAXRRHD300A1.8μm色谱柱有50mm和100mm两种长度规格用于快速分离和高分离度分析，对于大多数复杂样品都能实现真正的高分离度分离。这些色谱柱在分析蛋白质时具有UHPLC性能的所有优势，不仅能提高效率，还能使客户对所有结果都信心百倍。下面是关于如何选择适合的安捷伦ZORBAX色谱柱来重现良好的蛋白质分离并提高所有分析结果准确度的介绍。

色谱条件分析

1安捷伦ZORBAXRRHD300SB-63色谱柱色谱条件

样品：核糖核酸酶A、细胞色素C和溶菌酶（3mg／mL）；

进样量：1μL：

流动相A：A含0.1％TFA的蒸馏水溶液，B含0.01％TFA的乙腈溶液：

梯度：0-2.5minB从10％增加到70％；

流速：1mL／min（-700bar）：

HPLC仪器：1290Infinity系列；

检测：紫外，280nm。

2安捷伦ZORBAXRRHD300SB-C8色谱柱色谱条件

样品：核糖核酸酶A。细胞色素C和溶菌酶（3mg／mL）；

进样量：1μL：

流动相A：A含0.1％TFA的蒸馏水溶液，B含0.01％TFA的乙腈溶液；

梯度：0-2.5minB从10％增加到70％；

流速：1mL／min（-700bar）：

HPLC仪器：1290Infinity系列；

检测：紫外，280nm。

3安捷伦ZORBAXRRHD300SB-C18色谱柱色谱条件

样品：核糖核酸酶A、细胞色素C和溶菌酶（3mg／mL）：

进样量：1μL：

流动相A：A含0.1％TFA的蒸馏水溶液，B含0.01％TFA的乙腈溶液；

梯度：0-2.5minB从10％增加到70％；

流速：1mL／min（-700bar）；

HPLC仪器：1290Infinity系列：

检测：紫外，280nm。

4安捷伦ZORBAXRRBD30-Diphenyl色谱柱色谱条件

样品：核糖核酸酶A、细胞色素c和溶菌酶（3mg／mL）；

进样量：1μL

流动相A：A含0.1％TFA的蒸馏水溶液，B含0.01％TFA的乙腈溶液；

梯度：0-2.5minB从10％增加到70％：

流速：1mL／min（-700bar）；

HPLC仪器：1290Infinity系列：

检测：紫外，280nm。

5安捷伦ZORBAX

RRHD

300SB-C18和300-Diphenyl色谱柱色谱条件

样品：核糖核酸酶A、细胞色素c和溶菌酶（3mg／mL）；

进样量：1μL：

流动相A：A含0.1％TFA的蒸馏水溶液，B含0.01％TFA的乙腈溶液；

梯度：0-2.5minB从10％增加到70％：

流速：1mL／min（-700bar）：

HPLC仪器：1290Infinity系列：

检测：紫外，280nm。