RNAi干扰电压门控钠通道scn8a基因对人宫颈癌SiHa细胞侵袭转移的影响

潘惠艳 赵 群 詹 阳 赵丽红 张卫华 吴玉梅

(1.首都医科大学附属北京妇产医院中心实验室，北京 100026;2.首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100026;3.首都医科大学附属北京妇产医院病理科，北京 100026)

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，侵袭和转移是影响宫颈癌患者预后的关键因素。电压门控钠通道(voltage-gated sodium channels，VGSC)蛋白家族由九个成员组成，分别命名为Nav1.1～Nav1.9，其主要分布于神经、肌肉和神经内分泌细胞，负责细胞膜的兴奋和传播动作电位［1］。近年来，研究显示［2-3］VGSC在一些转移的癌细胞中表达，如Nav1.5亚型在乳腺癌、卵巢癌和结肠癌细胞中表达，Nav1.7亚型主要在前列腺癌细胞中表达，其与癌细胞的迁移和侵袭呈正相关。目前，国内外对VGSC在宫颈癌细胞中的研究较少，已发现在宫颈癌原代培养细胞中检测到VGSC电流，scn8a基因编码的产物Nav1.6亚型特异性阻止剂可抑制其电流，亦抑制细胞的侵袭［4］。首都医科大学附属北京妇产医院的前期研究［5］提示宫颈癌SiHa细胞株表达VGSC蛋白，但其表达亚型和作用仍不清楚。本研究采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，使用针对scn8a基因小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)转染宫颈癌SiHa细胞，观察其对细胞增生、迁移和侵袭的影响，探讨VGSC在宫颈癌细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1)细胞株:人宫颈癌细胞株SiHa细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。

2)试剂:10%胎牛血清和DMEM培养液(美国Gibico公司);5'－荧光素氨基磷酸酯-siRNA(6-FAM-siRNA，上海吉玛制药技术有限公司合成);Trizol和转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);RTPCR试剂盒(美国Promega公司);兔抗人Nav1.6多克隆抗体(以色列Alomone labs公司);抗β－肌动蛋白(β-actin)抗体(美国Sigma公司);Matrigel胶(美国BD公司)。

3)仪器和耗材:M450酶标仪(美国 Bio-Rad公司);FS-919PCR扩增仪(中国上海复生生物研究所产);细胞培养皿(美国Coring Costar公司);细胞培养箱(美国Thermo公司);Transwell小室(美国 Coring Costar公司)。

1.2 细胞培养及转染

人宫颈癌SiHa细胞孵育于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱及含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，经0.25%胰蛋白酶消化传代。将SiHa细胞以5×105个/孔接种于6孔板培养48 h后，利用脂质体LipofectamineTM2000将体外合成的siRNA转染细胞。每次实验分为4个组:空白对照组(未转染组)、脂质体组(Lipo对照组)、转染阴性对照(negative control，NC)组和scn8a RNAi转染组。参考来自GenBank的scn8a基因序列(序列号:374429548)，由上海吉玛公司设计合成siRNA寡聚核苷酸片段序列为5'-CCCAGUUCAUUGAGUACUGUA-3'(靶点为721～739 bp)。合成的阴性对照siRNA序列的有意义链分别为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUAA-3'，此顺序与人类基因无同源性。

1.3 总RNA提取及RT-PCR

采用半定量RT-PCR法检测scn8a mRNA的表达水平。SiHa细胞转染48 h后，用Trizol试剂提取细胞中总RNA，取总RNA 1μg，反转录获得cDNA，再进行半定量RT-PCR反应。目的基因scn8a的引物序列:上游引物5'-AGACCATCCGCACCATCCTG-3'，下游引物 5'-GGTCAACGGTATGTAGTGC-3'，扩增片段为517 bp。以 β-actin为内对照，扩增片段为268 bp。PCR反应条件为:95℃ 3 min后，94℃ 30 s，60℃30 s，72 ℃ 30 s，设定36 个循环。在扩增24、28、32 和36个循环时，取3μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，结果用溴化乙锭染色后紫外照相并进行扫描分析，以scn8a和 β-actin条带的吸光度值进行 scn8a mRNA表达水平定量分析，scn8a mRNA的相对含量=scn8a条带光密度吸光度值/β-actin条带的吸光度。

1.4 Western blotting

SiHa细胞转染48 h后，提取各实验组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，每泳道以50 μg蛋白质样品进行6%SDS-PAGE凝胶电泳，恒压100 mV电泳2 h后，恒流250 mA转膜4 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，用兔抗鼠Nav1.6多克隆抗体(1:500)于4℃培育过夜，TBST漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃摇床温育2 h，经ECL系统曝光显影，通过凝胶分析系统分析蛋白的表达。β-actin为内对照。Nav1.6蛋白的相对含量=Nav1.6蛋白条带吸光度值/β-actin(内对照)条带吸光度值。

1.5 MTT法测定细胞增生实验

转染SiHa细胞48 h，收集各组细胞。用PBS洗涤细胞后，以每孔1×105/mL的密度接种于96孔板中，再培养48 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)试剂，37℃孵育4 h，加入150 μL/孔的二甲基亚砜溶液，在酶标仪测定492 nm波长处各孔的吸光度值。各组细胞增生抑制率=［(对照组吸光值－实验组吸光值)/对照组吸光值］×100%。

1.6 划痕实验检测细胞的迁移能力

SiHa细胞转染48 h，收集各组细胞。PBS洗涤细胞后，用含10%胎牛血清DMEM培养基制成细胞悬液，按8×105个/孔的密度接种到6孔板培养24 h后，吸掉培养液，用10 μL洗液尖(Tip头)沿着培养板底部划“一”字形划痕，PBS洗去未贴壁细胞，拍照记录，并在划痕每侧边缘均匀选取30个点后取其中线代表划痕边缘，在带有标尺的倒置显微镜下测量细胞划痕间距，记录间距(0 h)。划痕后24 h，细胞换液，在48 h，同法在每侧边缘均匀选取30个点后取其中线代表划痕边缘，记录间距(48 h)。细胞迁移距离=间距(0 h)－间距(48 h)。

1.7 Matrigel侵袭实验

在12孔板Transwell上室加入1 g/L的Matrigel胶50 μL，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中过夜。胶凝固后，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养液500 μL。SiHa细胞转染48 h，每组细胞以2 ×105个/孔置于200 μL悬液(含1%胎牛血清的DMEM)加入Transwell上室，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养48 h后，取出上室，下室以95%乙醇固定15 min，HE法染色，计数侵入下室的细胞。计数时取中央和四周各5个视野，计算平均值。细胞的侵袭指数/%=(下室细胞数/上室接种细胞数)×100%。

1.8 统计学方法

应用SPSS11.5软件进行统计学分析。数据以均数 ±标准差()表示，用单因素方差分析及均数多重比较。两样本均数间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA的转染率及对scn8a mRNA和Nav1.6蛋白表达水平的影响

以6-FAM荧光标记的阴性对照RNA及特异siRNA转染SiHa细胞6 h后，在荧光显微镜下观察转染效率，均可见达90%左右，详见图1A。

图1 siRNA转染效率及其对scn8a mRNA和Nav1.6蛋白表达水平的影响Fig.1 Transfection efficiency and the expression of mRNA and Nav1.6 protein after RNAi targeting scn8a

为了解siRNA对SiHa细胞scn8a mRNA水平的影响，转染细胞48 h后，提取各组细胞RNA，半定量RTPCR结果显示(图1B)，RNAi组scn8a mRNA相对值为(23.3±4.2)%，明显低于未转染组(62.5±3.6)%、Li-Po组(59.6±5.0)%和阴性 RNAi转染组(58.0±3.5)%，与3者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。RNAi组较未转染组scn8a mRNA水平降低(62.7±5.8)%(P＜0.05)，而LiPo组和阴性RNAi转染组与未转染组比较，差异无统计学意义(P=0.291)。

在SiHa细胞转染48 h后，使用Western blotting检测各组Nav1.6蛋白水平(图1C)，结果显示RNAi组Nav1.6蛋白相对值为(18.6±3.8)%，表达水平明显低于未转染组(54.3±6.4)%、LiPo组(50.7±5.1)%和阴性RNAi转染组(52.5±4.6)%。RNAi组较未转染组Nav1.6蛋白表达降低(65.8±5.8)%(t=3.17，P ＜0.05)，LiPo组和阴性 RNAi转染组分别与未转染组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 scn8a的 RNAi对宫颈癌 SiHa细胞的增生无影响

MTT法检测结果显示(表1)，SiHa细胞在siRNA转染48 h后细胞吸光度值(0.556±0.038)与未转染组(0.545±0.043)、LiPo对照组(0.560±0.048)和阴性RNAi转染组(0.549±0.036)吸光值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，提示Nav1.6活性未影响SiHa细胞的增生。

表1 siRNA抑制scn8a表达对SiHa细胞增生无影响Tab.1 siRNA targeting scn8a had no effect on proliferation of cervical cancer SiHa cells

2.3 scn8a的RNAi降低宫颈癌 SiHa细胞的迁移能力

划痕实验结果显示(图2)，RNAi组24 h细胞的迁移距离(0.28±0.04)mm明显小于未转染组(0.63±0.06)mm、LiPo组(0.58±0.05)mm和阴性RNAi转染组(0.61±0.04)mm，与3者分别进行比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。RNAi组较未转染组迁移距离降低55.6%(t=3.68，P＜0.05)，而LiPo组和阴性RNAi转染组与未转染组比较，差异无统计学意义(P=0.213)。

图2 划痕48 h后，SiHa细胞的迁移结果Fig.2 The‘wound’images at 48 h after initial‘wound’(100 ×)

2.4 scn8a的 RNAi抑制宫颈癌 SiHa细胞的侵袭能力

Magrigel侵袭实验结果表明(图3)，RNAi组SiHa细胞的侵袭指数(8.2±2.4)%明显低于未转染组(13.0±1.8)%、LiPo组(13.3±2.0)%和阴性RNAi转染组(13.6±1.6)%，RNAi组与其余3者进行统计学比较，差异有统计学意义(t=2.98，P＜0.05)。RNAi组细胞侵袭较空白对照组降低36.9%(t=2.98，P＜0.05)，LiPo组和阴性 RNAi转染组分别与未转染组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

图3 针对scn8a基因siRNA降低SiHa细胞的侵袭能力Fig.3 Transfection of siRNA targeting scn8a gene supressed the Matrigel invasion of cervical cancer SiHa cells.

VGSC是“可兴奋”细胞膜上的跨膜糖蛋白，依赖细胞膜上电压变化而激活。VGSC家族由九个成员组成，其中Nav1.6和Nav1.7主要表达于外周神经，Nav1.5主要表达于心肌，Nav1.4主要表达于骨骼肌，其他亚型分别表达于外周和中枢神经细胞［6］。有报道［7］，scn8a基因突变常会导致肌张力障碍、震颤、共济失调等异常，其他亚型的异常可引起癫痫、慢性疼痛综合征、阿尔茨海默病(Alzheimer)等疾病。随着近年来对肿瘤研究的深入，有报道［2-3］显示VGSC在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌等细胞中表达，其涉及肿瘤细胞的侵袭转移。RNAi技术是mRNA水平上沉默特定基因的一种较新方法，能够抑制内源性或外源性基因的表达，具有稳定性高、快捷、高效特异等优点，已成为肿瘤研究中的理想工具。

本研究采用RNAi技术沉默宫颈癌SiHa细胞scn8a基因表达，观察到细胞可有效转染并明显抑制scn8a mRNA及其蛋白Nav1.6水平，表明实验所用的RNAi干扰序列特异性地抑制scn8a表达。在观察RNAi沉默scn8a基因表达后细胞的增生变化时，未观察到其对SiHa细胞增生有显著影响。此结果与本课题组前期在宫颈癌ME180细胞的研究结果［5］相一致，VGSC阻滞剂海豚毒素(tetrodotoxin，TTX)对ME180细胞的增生无明显影响，这亦提示Nav1.6活性未涉及宫颈癌细胞的增生。目前对VGSC涉及肿瘤细胞增生有不同报道，有报道［8］显示Na+内流促进癌细胞的增生，如瞬间Na+内流发生于增生早期，控制外在Na+浓度可有效抑制细胞增生［8］。在人脐静脉内皮细胞检测到 Nav1.5和 Nav1.7亚型，其中RNAi抑制Nav1.5表达可抑制细胞增生［9］。然而，在高转移潜能的前列腺癌Mat-Lylu细胞和乳腺癌MDAMB-231细胞，TTX对细胞增生无作用，即VGSC活性不涉及癌细胞的增生［10-11］。这些差异可能是由于细胞类型不同所导致。

本研究显示，RNAi沉默宫颈癌SiHa细胞scn8a基因表达后，细胞的迁移和Matrigel侵袭明显下降，这说明Nav1.6表达参与宫颈癌细胞的侵袭转移。有报道［12-13］显示小鼠前列腺癌Mat-Lylu细胞和人前列腺癌PC-3细胞主要表达Nav1.7亚型，VGSC阻断剂TTX分别抑制细胞迁移达47%和61%，抑制细胞Matrigel侵袭达33%和42%。乳腺癌高转移潜能的MDA-MB-231细胞表达Nav1.5亚型，TTX抑制细胞的迁移Matrigel侵袭分别为52%和49%［11］。House C D等［3］报道在结肠癌 HT29、SW620和 SW480细胞中检测到Nav1.5亚型，针对scn5a基因RNAi和钠离子通道阻滞剂TTX均抑制细胞Matrigel侵袭超过50%。在人脐静脉内皮细胞中，RNAi阻止Nav1.7表达可抑制细胞的趋向运动［9］。这些结果支持目前在宫颈癌SiHa细胞中的发现，即VGSC Nav1.6亚型涉及细胞的迁移和侵袭。

目前对VGSC参与肿瘤细胞侵袭转移的机制仍不清楚，考虑有以下两个方面［14-15］:①VGSC表达可引起细胞内Na+浓度增加，进而使细胞内环境改变，其中包括 Ca2+浓度增加［16］(Na+/Ca2+交换增多)、pH发生变化［17］(Na+/H+交换增多，H+-ATP酶活性增加)以及Na+依赖的酶(蛋白激酶A、组织蛋白酶等)激活［18］，其可引起癌细胞迁移、侵袭和分泌等细胞行为的改变，涉及到癌细胞侵袭转移。②VGSC由α或β亚单位组成，其均可与细胞膜/或细胞质内蛋白结合［19］，其中包括细胞骨架蛋白锚蛋白(ankyrin)，黏附分子等［20］，最终影响细胞的转移。

综上所述，本研究结果提示，VGSC Nav1.6亚型在宫颈癌SiHa细胞中表达，利用siRNA可有效抑制scn8a表达，进而抑制SiHa细胞的迁移和侵袭能力，这对于开发和利用scn8a基因作为治疗宫颈癌转移的靶点提供了新的思路。

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