嗜盐紫色硫细菌283－1的耐盐机制

崔小华，林志华，杨素萍，2

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原030006；2.华侨大学 生物工程与技术系，福建 厦门361021）

中度嗜盐菌是一类能够在0.1%～32%NaCl浓度条件下生长，最适生长NaCl浓度为5%～10%的极端微生物［1］。它们广泛分布于细菌域的各主要系统发育分枝上，包括好氧化能异养菌、厌氧化能异养菌、光能自养菌、光能异养菌、化能无机营养细菌等多种营养类型的细菌。细菌适应高渗透压的机制有两种：一种是KCl型，另一种是相容性物质型［2］。大多数中度嗜盐菌的耐盐机制为相容性物质型，它们通过大量积累相容性物质来对抗外界的高渗透压。这些相容性溶质主要包括：多糖类（海藻糖）、聚醇（甘油）、氨基酸（谷氨酸、脯氨酸）和氨基酸衍生物（甜菜碱、四氢嘧啶）［3］。甜菜碱是一类非常有效的相容性物质，它在细菌和抗高盐高等植物中广泛存在，很低浓度的甜菜碱也有良好的渗透保护作用。中度嗜盐的光合细菌和嗜盐放线多孢菌可以在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中从头合成甜菜碱，而其他中度嗜盐细菌只能从培养基中直接吸收甜菜碱或其前体胆碱［4］。文献报道，外源甜菜碱能显著提高肠道细菌和根瘤菌等非耐盐细菌的耐盐抗旱能力［5，6］。由于中度嗜盐菌代谢类型多样而且具独特的生理性质，它们在食品工业﹑酶制剂生产﹑基因工程﹑化妆品生产﹑多聚体生产﹑环境污染的生物修复等领域具有广泛的应用价值［7］。

本课题组分离到一株耐高浓度硫化物且能以亚硝酸盐作为唯一氮源的中度嗜盐紫色硫细菌，它在去除污水中碳、氮、磷和有毒物质硫化物的环境治理中具有广泛的应用前景。已报道具有代表性的中度嗜盐光合菌主要在Ectothiorhodospiraceae科［8］和 Marichromatiaceae科［9］，Marichromatiaceae科耐盐机制方面的报道较少。菌株283－1属于Marichromatiaceae科，本实验对其耐盐特性和机制进行初步研究，为中度嗜盐紫色硫细菌283－1的实际应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

紫色硫细菌283－1从青岛盐池卤水中分离。

1.2 培养基和培养条件

采用改良的Pfennig紫色硫细菌培养基［10］。培养液接种后起始OD660约为0.05，培养条件为2500lux，28℃，光照厌氧培养4d。

1.3 生物量的测定

采用比浊法，以660nm吸光度（OD660）表示生物量。取适量培养液用紫外可见分光光度计测定OD660。

1.4 无机盐对菌株生长的影响

将菌株283－1接种于含0～2.6mol·L－1NaCl培养基中，测定生物量。

在无NaCl的培养基中，分别控制Na＋和Cl－的浓度为0.85mol·L－1，按需要加入 NaF 、NaCl、NaBr、NaNO3、Na2SO4、Na2SO3和 LiCl、NaCl、KCl、MgCl2，将菌株283－1分别接种于上述培养基中培养，测定生物量。

1.5 渗透压冲击对菌株生长的影响

将0.17、1.71和1.85mol·L－1NaCl浓度下生长的283－1接种物分别接种在含有0.85和1.36 mol·L－1NaCl的培养基中，测定生物量。

1.6 相容性溶质对菌株生长的影响

在含0.85和1.71mol·L－1NaCl的培养基中分别添加终浓度均为1mmol·L－1相容性溶质谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蔗糖、海藻糖、甘油和甜菜碱。将283－1菌株接种于上述添加不同相容性溶质的培养基中，测定生物量。

1.7 胞内相容性溶质的提取和测定

参照Anne U.K等的方法［11］提取菌株283－1胞内相容性溶质，冻干样品用水溶解。采用茚三酮比色法测定游离氨基酸；用反相HPLC色谱法测定甜菜碱含量［12］。

2 结果与分析

2.1 无机盐对菌株耐盐生长的影响

菌株283－1接种于不同NaCl浓度培养基中培养结果见图1。菌株283－1能在含0～2.3mol·L－1NaCl的培养基中生长，最适生长NaCl浓度范围为0.51～0.85mol·L－1，因此菌株283－1为中度嗜盐紫色硫细菌。9种无机盐对283－1生长的影响见图2。6种钠盐中NaCl、NaBr和NaNO3均可以提供菌株生长的渗透压，但NaCl中生长最好，说明Cl－调节渗透压的能力较其它阴离子更有效；4种氯化物中，菌株仅在NaCl中生长，说明该菌株生长对Na＋的专一依赖性。

图1 NaCl对菌株283－1生长的影响Fig.1 NaCl effect on the growth of strain 283－1

图2 无机盐对菌株283－1生长的影响Fig.2 Effect of inorganic salt on growth of strain 283－1

2.2 渗透压冲击对菌株耐盐生长的影响

不同NaCl浓度下生长的接种物分别接种到0.85和1.36mol·L－1NaCl培养基中培养，结果见图3。在0.85mol·L－1NaCl的培养基中不同盐浓度培养的接种物对菌株生长影响不明显，在1.36mol·L－1NaCl的培养基中1.71mol·L－1NaCl下生长的接种物较0.17和0.85mol·L－1NaCl浓度下生长的接种物有明显的生长优势。这说明高盐下生长的接种物胞内已具备适应高渗透环境的生理条件，不需要较长的适应期而直接进入对数生长，从而能较快速的达到最大生物量。

图3 渗透压冲击对菌株283－1生长的影响Fig.3 Effect of osmotic shock intensity on growth of strain 283－1

2.3 相容性溶质对菌株耐盐生长的影响

菌株在添加不同相容性溶质的培养基中生长的结果见图4。与不添加相容性溶质的培养基相比较，在含有0.85mol·L－1NaCl的培养基中添加加相容性溶质对菌株283－1的生长影响不明显；在1.71mol·L－1NaCl的培养基中，外加1mmol·L－1甜菜碱显著提高了菌株283－1的耐盐生长的能力，谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖和海藻糖在该盐浓度下对其生长没有影响，说明甜菜碱是菌株283－1耐盐生长的相容性溶质。

图4 不同渗透压冲击对菌株283－1生长的影响Fig.4 Effects of compatible solutes on growth of strain283－1

2.4 NaCl对菌株胞内游离氨基酸的影响

NaCl对菌株胞内游离氨基酸的影响见表1，随着培养基中NaCl浓度的升高，菌株283－1胞内总游离氨基酸含量缓慢增加，但增加的量远远低于文献中报道的结果［13］，说明NaCl浓度变化对菌株283－1胞内游离氨基酸总量影响不明显。由此可见，当外界盐浓度高于最适生长盐浓度时，细胞需要其它相容性物质来对抗外界的渗透压，为此我们研究了盐度对菌株胞内甜菜碱含量的影响。

2.5 NaCl对菌株胞内甜菜碱的影响

不同盐浓度下胞内甜菜碱的含量见表1，随着培养液渗透压的增加，胞内甜菜碱的含量明显增加，当菌株在0.51mol·L－1NaCl的培养基中生长时，胞内甜菜碱含量为33.8mg·g－1菌体干重；当NaCl浓度为1.87mol·L－1时，胞内甜菜碱的含量可达141.8mg·g－1菌体干重，提高了4倍多。结果与以甜菜碱为相容性溶质的文献结果一致［13］，说明甜菜碱是菌株283－1耐盐生长的主要相容性溶质。

表1 NaCl对胞内游离氨基酸和甜菜碱含量的影响Table 1 NaCl effects on the content of intracellular free amino acids and betaine

3 讨论与结论

由于极端微生物特殊的生理结构和代谢机制，近年来嗜盐菌逐渐成为研究热点。中度嗜盐菌的耐盐机制复杂多样，胞内积累相容性溶质是重要机制之一。相容性溶质主要有海藻糖、甘油、谷氨酸、脯氨酸、甜菜碱、四氢嘧啶等，其中甜菜碱是一种非常有效也是研究较多的一种相容性物质。283－1是一株中度嗜盐紫色硫细菌，它能够胞内积累较高含量的甜菜碱，且随着培养基盐度的提高甜菜碱含量明显增加，因此胞内积累甜菜碱是该菌株耐盐生长的重要机制。

外源甜菜碱能显著提高非耐盐细菌的耐盐抗旱能力，而且紫色硫细菌生境特殊能够耐高浓度硫化物，因此对紫色硫细菌283－1及其耐盐机制的深入研究，不仅为甜菜碱的生产和甜菜碱合成基因的应用研究提供理论基础而且在环境治理中具有重要的意义。

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