Gateway技术构建结缕草低温和干旱诱导cDNA文库及其质量鉴定

王 舟，宗俊勤，郭海林，刘建秀

(1.江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京210014；2.广西梧州市产品质量监督检验所，广西 梧州543001)

结缕草(Zoysiajaponica)是暖季型草坪草中最抗寒的草种，具有良好的耐旱、耐盐碱、耐践踏、耐瘠薄、抗病虫害等特性[1-2]，这决定了它拥有众多的优良性状和丰富的遗传多样性，是很好的研究植物抗性机制的草坪草。而如何有效发掘利用这些有利基因一直是研究的热点，但结缕草遗传背景复杂，通过常规的基因克隆方法获取有利基因存在许多问题，效率极低。cDNA文库的构建是研究不同发育阶段和特定时期的基因表达、分离组织特异性基因以及克隆新型细胞因子的有利工具[3-4]。由于cDNA文库是生物体在特定发育时期转录的全部mRNA经反转录而成的cDNA片段与载体连接形成的克隆的集合，故不含有内含子[5-6]。源于这些cDNA片段的短的、单向测定的序列片段即为表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)，是一种发现新基因和研究基因表达谱的有效工具[7-8]。通过大规模的EST测序分析，可以获得基因组中编码序列区的核苷酸全序列图，并可通过已知功能基因的相似性分析推测每条EST所代表基因的功能。自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，cDNA文库已经被广泛应用于构建遗传学图谱、分离与鉴定新基因、基因差异表达和比较基因组学、功能基因组学等研究[9]。目前拟南芥(Arabidopsisthaliana)[10-11]、水稻(Oryzasativa)[12]、小麦(Triticumaestivum)[13]、玉米(Zeamays)[14]和棉花(Gossypiumhirsutum)[15-16]等重要植物的全长cDNA文库已成功构建并用于后期蛋白质表达及功能分析[17-18]。近年来，EST和cDNA文库筛选已成为一种高效率、低成本的发现未知新基因的快捷技术[9,19-20]。特别是对非模式物种，通过cDNA文库筛选目的基因更具明显优势[21]。

相对于拟南芥、水稻、小麦等植物，结缕草的分子生物学研究还属起步阶段，多集中于采用分子标记手段进行遗传分析及亲缘关系的鉴定[22-25]，而对功能基因的分离研究鲜有报道。截至目前，GenBank中登录的来源于结缕草的核苷酸序列仅有197条，远远落后于其他园艺观赏植物，而dbEST中甚至没有结缕草EST的登录信息记录。在这197条序列中绝大部分为叶绿体相关基因，其次为线粒体相关基因、NADH脱氢酶基因等，而对这些基因的研究多是用作分子标记为鉴定结缕草品种亲缘关系服务的。结缕草基因的分离主要是通过蛋白质纯化、N端氨基酸序列分析以及RACE等方法获得，而有关结缕草cDNA文库方面的研究国内外尚未见报道。

为进一步获取结缕草抗逆信号转导途径中的关键基因信息，从分子水平深入挖掘和利用结缕草潜在的基因资源，完善其基因组信息，本研究以坪用价值高的优良结缕草品种Meyer为建库材料，经低温和干旱诱导处理，采用先进的Gateway技术首次成功地构建了包含结缕草抗寒、抗旱特异性表达基因的高质量cDNA文库，旨在为今后大规模EST测序、基因表达谱分析、分离克隆具有育种价值的抗逆相关基因，研究其功能及代谢途径和网络提供理论依据和技术支撑，为开展分子育种工作开辟一条新的途径。这对改善我国草坪业的自主知识产权现状具有重要意义。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料 供试结缕草品种为美国引进的优良品种Meyer(Z.japonicacv.Meyer)。对在自然条件下萌发生长6周的健壮植株分别进行低温和干旱处理。1)低温处理：将材料置于4 ℃下冷处理5～6 h；2)干旱处理：将材料置于25 ℃人工培养箱中，停止浇水4～5 d，直至土壤出现龟裂。收集上述处理材料的叶片用液氮速冻后，-80 ℃保存备用。

1.1.2文库载体 pCMV·SPORT6，具有Gateway兼容性(Gateway Compatibility)，在其多克隆位点(Multiple Cloning Site，MCS)的双侧翼含有GatewayattB1和attB2重组位点。

1.1.3主要试剂 cDNA文库构建试剂盒(SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning)、RNA提取试剂(TRIzol Reagent)、mRNA分离试剂盒(FastTrack 2.0 Kit)、反转录试剂盒(SuperScriptTMII First-Strand Synthesis System for RT-PCR)、DNA分子量标记(1 kb Plus DNA Ladder)、超纯琼脂糖(UltraPureTMAgarose)、热启动型DNA聚合酶(Platinum Taq DNA Polymerase)、dNTP混合液(100 mmol·L-1dNTP Set)、超纯酚∶氯仿∶异戊醇[UltraPureTMPhenol∶Chloroform∶Isoamyl Alcohol (25∶24∶1，体积比)]均购自Invitrogen公司，分子生物学用醋酸铵[Ammonium acetate solution for molecular biology (7.5 mol·L-1)]购自Sigma公司。

1.2试验方法

1.2.1总RNA的提取 分别取-80 ℃下保存的低温、干旱诱导后的两种样品各100 mg混合，于加有液氮的研钵中迅速研磨后，转移至RNase-free的1.5 mL离心管中，立即加入1 mL TRIzol提取液，混匀后，后续的操作参照TRIzol说明书进行总RNA的提取。沉淀用75%乙醇洗涤，DEPC处理水溶解，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和稳定性，并用紫外分光光度计测定RNA的纯度及含量。

1.2.2mRNA的分离 取大于500 μg的总RNA，参照试剂盒FastTrack 2.0 Kit操作说明书分离和纯化mRNA。

1.2.3双链cDNA的合成 取5 μg的mRNA，按照试剂盒SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning使用说明进行操作，SuperScriptTMII RT酶合成cDNA第1链。随后，参照试剂盒操作程序合成cDNA第2链。

1.2.4柱层析分级分离及收集 取25 μL cDNA与10 μLSalI接头(50 ng·μL-1)，T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜。连接产物用限制性内切酶NotI于37 ℃酶切3 h，产生粘性末端。酶切产物过cDNA Size Fractionation Columns柱(试剂盒提供)，并按试剂盒使用说明收集前150 ng的cDNA产物。

1.2.5连接载体 依试剂盒要求取10 μL cDNA与1 μLNotI-SalI-Cut pCMV·SPORT6载体，在T4 DNA连接酶作用下室温反应3～5 h或4 ℃连接过夜。

1.2.6电转化大肠杆菌DH10B 参照试剂盒说明书，在冰上将2 μL连接产物和50 μL电转感受态细胞DH10B加入电转杯。TX ECM 630电转化仪上电击条件设置为：电压2.0 kV，电阻200 Ω，电容25 μF。电击后迅速向电转杯中加入冰上预冷的SOC培养基1 mL。将电转物全量转移至新的1.5 mL离心管中，37 ℃ 225～250 r·min-1振荡培养1 h，获得原始文库。

1.2.7文库质量评价

1)滴度和库容量鉴定：取电转化后的原始文库原液10 μL稀释1 000倍后，从中取出50 μL涂布于IPTG/X-Gal的LB平板(含100 μg·mL-1氨苄青霉素)上，37 ℃培养过夜，次日统计菌落数。

2)插入片段大小及重组率鉴定：从原始文库中随机挑取50个单克隆，以M13F-M13R为引物，PCR检测插入片段大小并估计文库重组率。95 ℃变性5 min裂解菌体后，加入PCR反应混合物，扩增反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析插入片段的大小。

2 结果与分析

2.1总RNA的提取 RNA的完整度与稳定性决定了cDNA的质量，是构建高质量cDNA文库的关键。提取经低温、干旱诱导后的结缕草叶片总RNA，取2 μL RNA溶液进行1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果可见两条清晰的28S和18S rRNA条带(图1)，表明提取的总RNA具有良好的完整度及稳定性。紫外分光光度计检测RNA溶液的OD值，测得OD260 nm/OD280 nm=1.90，说明RNA纯度较好，可以用来分离mRNA，为建立高质量结缕草cDNA文库奠定了基础。

图1 提取的结缕草总RNA

2.2mRNA的分离与纯化 采用FastTrack 2.0 Kit试剂盒从总RNA中分离和纯化mRNA。电泳检测显示，mRNA呈均匀弥散状(图2)，主要分布在1 000 bp以上，质量良好，符合建库的要求。

图2 分离和纯化后的mRNA

2.3反转录与双链cDNA的合成 用约5 μg mRNA反转录合成双链cDNA(ds cDNA)，取5 μL反转录产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果可见，ds cDNA呈弥散状条带，主要分布于1 000 bp以上(图3)，说明不同大小和不同丰度的mRNA都得到了有效的反转录和扩增，满足建库的需要。

图3 反转录合成的双链cDNA

2.4文库质量评价

2.4.1cDNA原始文库的滴度和库容量鉴定 原始文库滴度可估计cDNA文库的克隆数，同时还代表了mRNA的复杂度。将过柱收集的cDNA片段与质粒载体pCMV·SPORT6连接后，转化到受体菌DH10B。按照SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning试剂盒提供的方法进行文库滴度和库容量的测定。

一个高质量的文库，其滴度应大于1×106pfu·mL-1，库容量应大于5×106pfu[26]，能保证低丰度基因的出现频率达到99%[27]。原始文库稀释1 000倍后，取50 μL涂布，获得克隆数88个，经计算得到文库的滴度为1.76×106pfu·mL-1，库容量为7.04×106pfu。由此可见，本研究构建的结缕草低温和干旱诱导cDNA文库是一个较高质量的文库，足以克隆到低丰度表达的基因。

2.4.2插入片段大小和重组率鉴定 插入片段大小和重组率是评价cDNA文库质量的另外两个重要指标。从原始文库中随机挑取的单克隆PCR检测结果表明，文库重组率达到90%。插入片段最大可达2.5 kb，主要集中在大于1 kb的区域(图4)。植物cDNA一般为0.5～3.0 kb，大多大于或等于1 kb[28]。本研究构建的文库符合构建高质量文库的标准，文库中长片段所占比例较大，表明插入片段序列的完整性较好，适合以后的测序及后续筛选基因与基因功能的研究。

图4 cDNA文库插入片段大小的PCR检测

3 讨论

植物基因组的研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向功能基因组学，通过cDNA文库筛选分离全长基因和开展基因功能研究已成为功能基因组学研究的基本手段之一。cDNA文库代表了mRNA的反转录复本[29-31]，高质量cDNA文库的构建是大规模EST测序的必要保证，也是有效研究基因表达的基础。cDNA文库的质量主要反映在两个方面：一是文库的代表性，即文库中含有的cDNA种类的完整性。只有足够的克隆数才能保证拥有一定数量的低丰度表达的mRNA，反映来源细胞中所表达的全部遗传信息。其可用滴度和库容量的大小来定量衡量，滴度越大表明获得目的基因的可能性越大。二是插入cDNA片段的序列完整性。只有大部分克隆含有接近全长的cDNA插入，文库才能体现天然的、完整的遗传信息，即插入片段的大小越大，表明分离到基因全长的可能性越大。本研究对结缕草供试材料进行了低温和干旱的诱导处理，可以大幅度提高目的诱导基因的表达丰度，理论上即使是低丰度的基因也可以获得筛选。此外，从PCR鉴定文库质量的结果来看，cDNA片段插入重组率高达90%，这也为今后基因分离的效率提供了有力保证。

文库的滴度、重组率和插入片段的大小是鉴定cDNA文库质量的重要指标[4,32]。滴度的高低是能否通过筛选cDNA文库获得目的基因的衡量依据，高库容量是文库测序获得非重复EST的保证[32]。一般而言，在典型的真核生物中每时每刻表达的mRNA约占生物所有基因的15%，约1.5万种，其中低丰度mRNA种类约占30%[33]。为使文库中出现某种低丰度的mRNA这一事件的发生达到给定的概率，则文库所需的独立克隆数，可以通过Clack-Carbon公式N=ln(1-P)/ln(1-f)(N为实际所需克隆数，P为要求的概率，f为1/n，n为某一类型的稀有mRNA在总mRNA中所占的相对比例)计算。当要求筛选到某低丰度mRNA的概率为99%时，由上述公式计算出的文库所需克隆数应不低于1.7×105pfu·mL-1，此即为有效的文库[32]。但为满足筛选到低丰度mRNA的要求，一般cDNA文库构建要求其滴度不少于1×106pfu·mL-1[34]。构建文库过程中，片段分级分离与载体连接时，cDNA片段大小与cDNA浓度对建库的影响至关重要，如不能有效去除小片段cDNA，则其会优先与载体连接，导致文库平均插入片段过小，严重影响文库质量，但过度筛除cDNA片段，则会造成文库的初始滴度下降，从而丢失一些基因信息。分级分离的标准一般是回收500 bp以上的cDNA片段[35]。针对构建文库筛选功能基因全长的目的，本研究在保证插入片段较大的同时，兼顾了文库的滴度。经检测，本研究所构建的cDNA原始文库滴度为1.76×106pfu·mL-1，保证了文库的完整性与覆盖度，理论上包含了胁迫诱导后结缕草叶片中表达的所有基因[32,36-37]；插入片段的平均大小超过1 kb，重组率为90%，表明序列的完整性很高，能够包含绝大多数基因表达的cDNA信息，保证了在通过筛选cDNA文库获取目的基因时稀有基因不会被遗漏[32,36-37]。由此可见，所构建的文库达到了完整、有效并且高质量的标准，满足分离低丰度表达基因序列的要求，可用于后续筛选其中特异表达的低丰度基因、组织特异性基因表达谱分析、基因组序列的功能注释以及功能基因在转录及翻译水平上调控的分子机制等许多领域的研究。通过EST测序、分子杂交、扣除法等技术探明结缕草生长、发育、次生代谢和生化合成途径及对环境胁迫反应的分子机理[38-40]，不仅为后期在分子水平上调控结缕草的生长、发育和抗逆性奠定了实验基础，还提供了技术平台和良好的前提材料。

本研究是利用Gateway技术构建的高质量全长cDNA文库，因此文库所分离的cDNA克隆包含了相对应的mRNA分子完整的序列。此文库所用的克隆载体pCMV·SPORT6，具有Gateway兼容性，在其多克隆位点的双侧翼含有Gateway位点特异性的重组位点(attB1和attB2)，cDNA克隆位点即位于多克隆位点内。因此，通过位点特异性重组就可将从文库分离到的克隆快速转化至其他Gateway载体，而无需经过限制性内切酶的酶解和连接酶的连接。Gateway克隆可以方便地用于DNA测序、RNA探针制备或者表达重组蛋白。此外，在文库构建的过程中第2链合成采用的是置换合成法，而没有采用PCR扩增，能够保持材料中的mRNA原始丰度，而不会由于PCR扩增效率的不同，使得原始丰度在文库中反映失真，这使一些较低拷贝数基因的克隆具有优势。同时，作为优化的文库系统及后期大规模测序结果可以应用于进一步的芯片制作。

cDNA文库筛选和RACE技术是两种获得全长cDNA最重要的方法，其中cDNA文库筛选还具有高通量的特点，适合于大规模获得全长cDNA。在此基础上分析不同基因在逆境胁迫过程中的表达，从中筛选出特异性表达的基因，进一步分析其功能，并最终研究抗逆相关基因调控网络，为育种工作奠定理论基础。与农作物(如水稻、小麦等)相比，国内外对草坪草和牧草的开发利用，特别是分子生物学相关研究，还处于起步阶段。本研究构建了低温和干旱诱导的结缕草叶片cDNA文库，文库中功能基因的数量、基因表达的丰度与结缕草自身抗寒、抗旱等抗逆性密切相关。目前在公共数据库中，报道结缕草cDNA文库尚属首次。此高质量文库的成功构建是鉴定和克隆相关重要功能基因及开展分子育种的重要平台，有助于深入了解结缕草遗传背景，揭示其抗逆性的分子机理，为进一步获得拥有自主知识产权的抗逆新品种提供了有力的保障，具有重要的应用价值。

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