花生四烯酸环氧化酶-2途径参与丹参改善老年自发性高血压大鼠的心肌纤维化

王建军, 刘 杰



花生四烯酸环氧化酶-2途径参与丹参改善老年自发性高血压大鼠的心肌纤维化

王建军1*, 刘 杰2

（1南京军区福州总医院干部病房二科, 福州 350025;2华中科技大学附属协和医院心血管内科, 武汉 430022）

探讨丹参对于老年自发性高血压大鼠（SHR）心肌纤维化的逆转作用和可能的作用机制——花生四烯酸环氧化酶途径。实验采用17个月龄的SHR分别连续给予12周的丹参注射液和生理盐水对照, 选取同周龄的WKY大鼠作为正常对照, 同时选用花生四烯酸环氧化酶-2（COX-2）的特异性抑制剂塞来昔布灌胃处理后注射丹参。测定血压、血流动力学、左心室质量指数, HE染色和Masson染色分析心肌细胞的大小或心肌纤维化水平, 左心室心肌COX-2的蛋白表达和活性水平。与老年WKY大鼠相比, 老年SHR高血压对照组血压显著增高[收缩压: （171±12）（125±3）mmHg; 舒张压: （115±9）（87±3）mmHg; 平均动脉压: （139±10）（106±5）mmHg;＜0.05], 心功能恶化[LVEDP: （13.9±1.7）（7.6±1.3）mmHg; LVdP/dtmax: （2528±167）（3015±217）mmHg/s; －LVdP/dtmax: （1957±134）（2501±175）mmHg/s,＜0.05], 左室质量指数增加[（3.45±0.07）（2.23±0.06）mg/g,＜0.05], 心肌细胞增大[心肌细胞直径: （23.5±0.4）（14.3±0.4）μm,＜0.05], 纤维化严重[心肌间质纤维化指数: （1.66±0.05）%（0.64±0.05）%; 心肌血管周围纤维化指数: （139±9）%（68±7）%,＜0.05], 心肌COX-2的蛋白表达水平增加[（125.8±7.2）（47.6±3.8）,＜0.05]以及活性增强[（73.9±5.6）（56.7±4.4）kU/g,＜0.05]。应用丹参的SHR组, 收缩压无显著变化, 其他指标均有显著下降（< 0.05）, 塞来昔布能够部分消除丹参的作用。丹参能显著逆转老年SHR的心肌纤维化水平, 该作用可能是通过花生四烯酸环氧化酶途径。

丹参; 大鼠, 近交SHR; 心肌纤维化; 花生四烯酸环氧化酶

高血压左心室肥大是心肌纤维对于慢性的压力或容量负荷的适应性反应, 是高血压患者发生充血性心力衰竭、冠心病、心律失常以及猝死等心血管事件的重要独立危险因素。肥大左心室中增加的胶原纤维的沉积使心功能不断恶化, 继而引起心力衰竭[1]。有效的降血压药物治疗不仅能降低血压, 更应该能够改善心肌的病理重构或纤维化[2]。丹参具有多种心血管保护功能, 唐忠志等[3]研究表明, 丹参虽然不能有效地降低血压, 但在预防和逆转心肌纤维化方面具有重要的作用。但丹参对于老年自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats, SHR）心肌纤维化的作用并不清楚, 而且逆转纤维化的机制也并不清楚, 本实验旨在研究丹参对于老年SHR心肌的作用和可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

17个月的老年雄性SHR（北京维通利华公司）, 体质量（418±6）g, 随机分为高血压对照组和高血压丹参组。同期选择17个月的老年雄性WKY大鼠作为对照, 体质量（476±10）g。丹参组连续给予12周的丹参注射液（雅安三九药业有限公司提供）腹腔注射, 剂量为1ml/（kg·d）, 1ml注射液含丹参生药1.5g, 即SMB-treated SHR。其他两组大鼠分别连续给予12周相同容积的生理盐水注射液。同时, 为了进一步观察丹参的作用机制, 我们选择了8只SHR大鼠, 在丹参注射液腹腔注射的同时, 给予花生四烯酸环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）特异性抑制剂塞来昔布灌胃处理, 即Celecoxib-treated SHR。

1.2 血压测定

采用无创大鼠尾动脉压测量连续每周检测血压和心率。血压仪为澳大利亚Powerlab公司生产的ML125/R, 8sp生物信号采集与处理系统。每次测定血压重复3次, 取平均值。

1.3 血流动力学评价

12周后每只大鼠称重, 麻醉后颈部气管插管接小动物呼吸机维持呼吸。分离右侧颈总动脉, 用充有肝素生理盐水溶液的PE-50聚乙烯管插入右侧颈总动脉, 经PowerLab数据分析处理系统记录动脉血压, 并对血压信号进行处理, 同步记录动脉血压。进一步插管进入左心室内, 记录左室舒张末期压力（left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP）、左室内压最大上升速率（LVdP/dtmax）用于评价心脏收缩功能, 左室内压最大下降速率（－LVdP/dtmax）用于评价心脏舒张功能。

1.4 左心室质量指数

大鼠称重后过量麻醉处死, 取出心脏用冰磷酸盐缓冲液冲洗血污后称重。剪去心房和右心室游离壁, 将左心室和室间隔准确称重。计算心脏质量指数（heart mass/body mass, HM/BM）和左心室质量指数（left ventricular mass/body mass, LVM/BM）。

1.5 病理切片

静脉注射过量的氯化钾注射液使心脏收缩停止于舒张期, 快速将心脏取出并用冰磷酸盐缓冲液（pH7.4）冲洗。心脏置于4%中性福尔马林溶液中室温固定8～12h, 然后梯度乙醇脱水。取左心室中部冠状切面包埋于石蜡中, 石蜡切片机上做5μm切片, HE染色, Masson's染色。HE染色用于观察单个心肌细胞直径, Masson's染色用于评价心肌纤维化水平。心肌纤维化分为心肌间质纤维化和心肌血管周围纤维化, 二者共同评价心肌纤维化水平[4]。

1.6 Western 免疫印迹法检测心肌COX-2蛋白表达

速取处死动物, 取出心脏左室前壁心肌, 液氮中冷冻, 保存于-80℃备用。提取所取心肌中的蛋白, BCA试剂盒测定蛋白浓度。从每组标本蛋白质样品中取50μg, 凝胶电泳分离, 转膜, 封闭后加入兔抗COX-2的单克隆抗体（Canda, Santa Cruz）。再加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体, 最后加入ECL试剂一曝光。使用β-Actin作为内参。将Western blot条带进行光密度值扫描。COX-2的表达方式: COX-2光密度/β-Actin光密度。

1.7 酶联免疫法检测外周血COX-2活性

使用酶联免疫（ELISA）的方法检测心肌COX-2活性, 试剂盒为西班牙Cayman公司, 批号为760151的COX-2试剂盒。按照说明书进行操作后, 使用美国Bio-tek公司的ELX800NB 酶标仪读取。标准曲线R值为0.9935。

1.8 统计学处理

所有指标均用“均数±标准误”表示, 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验, SNK法做两两比较。以< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 丹参对血压和心率的影响

高血压组大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压明显高于WHY大鼠, 且差异具有统计学意义（＜0.05）。在连续12周的检测中, 四组血压很平稳, 丹参组、塞来昔布组与高血压组比较, 收缩压、舒张压、平均动脉压差异无统计学意义（＞0.05; 表1）。

2.2 丹参对血流动力学的影响

高血压大鼠的血流动力学测定表明, 部分老年高血压大鼠心力衰竭, 心功能较差, 丹参可以改善高血压大鼠的心功能, 改善LVEDP、LVdP/dtmax、－LVdP/dtmax; 塞来昔布对SHR的LVEDP、－LVdP/ dtmax有显著改善作用, 但对LVdP/dtmax没有影响, 说明其可以取消丹参对心脏舒张功能的影响, 但不能取消丹参对心脏收缩功能的影响（表1）。

表1 四组的血流动力学指数

注: SBP: 收缩压; DBP: 舒张压; MAP: 平均动脉压; LVEDP: 左室舒张未压; SHR: 自发性高血压大鼠。与WKY组比较,*＜0.05; 与SHR组比较,#＜0.05

2.3 丹参对心脏解剖学指标的影响

高血压大鼠的心脏质量及体质量比明显高于正常对照组, 显示老年SHR呈现严重的左心室肥大。丹参对SHR 的体质量并无改善, 但可以明显降低左心室质量和左心室质量指数。塞来昔布能够取消丹参对左心室质量的影响, 但未能取消丹参对左心室质量指数的影响（表2）。

表2 四组的解剖学指标

注: BM: 体质量; LVM: 左室质量; LVMI: 左室质量指数; SHR: 自发性高血压大鼠。与WKY组比较,*＜0.05; 与SHR组比较,#＜0.05

2.4 丹参对心脏病理学指标的影响

心肌HE染色表明, 丹参可以降低SHR的心肌细胞直径, 塞来昔布不能取消丹参对心肌细胞直径的降低作用（图1）。Masson染色表明, 丹参可以改善心脏的纤维化, 尤其是改善心肌内血管周围的纤维化, 塞来昔布可以取消丹参改善心肌血管周围纤维化的作用（图2）。四组的组织病理学指标情况见表3。

2.5 心肌组织COX-2的表达水平

Western blot结果表明, SHR心肌组织中COX-2的蛋白表达水平增加。应用丹参后, SHR心肌组织中的COX-2水平降低, 塞来昔布能够取消该作用（图3）。

2.6 心肌组织COX-2的活性

ELISA结果表明, SHR心肌组织中COX-2的活性增加（＜0.05）。应用丹参后, SHR心肌组织中的COX-2活性降低, 塞来昔布能够取消该作用（表4）。

图1 四组心肌的心肌细胞直径比较

Figure 1 Myocardial cell diameter of four groups (HE staining´200)

A: WKY; B: SHR; C: 丹参处理SHR; D: 塞来昔布处理SHR

图2 四组心肌的心肌纤维化水平比较

Figure 2 Myocardial fibrosisoffour groups(Masson staining´200)

A,E: WKY; B,F: SHR; C,D: 丹参处理SHR; D,H: 塞来昔布处理SHR; A,B,C,D: 显示心肌间质纤维化; E,F,G,H: 显示心肌血管周围纤维化

表3 四组的组织病理学指标

注: 与WKY比较,*＜0.05, 与SHR比较,#＜0.05

图3 Western blot检测COX-2蛋白表达情况

Figure 3 COX-2 protein expression by Western blot (=8)

表4 COX-2的活性及表达情况

注: COX-2: 环氧化酶; SHR: 自发性高血压大鼠。与WKY比较,*＜0.05; 与SHR比较,#＜0.05

3 讨 论

长期的高血压会导致左心室肥厚, 高血压左心室肥厚主要表现为左心室质量指数增加, 心肌细胞肥大, 心肌的纤维化。心肌的纤维化可以分为心肌间质的纤维化和心肌血管周围的纤维化[5]。持久的高血压和心肌的纤维化增加了非心肌细胞在心脏中所占的比例, 对于心脏的收缩和舒张功能产生显著的负面影响, 最终会导致心力衰竭, 这在老年性长期高血压中更明显。

SHR是目前公认的最接近于人类原发性高血压的动物模型, 在13周时血压已近于稳定, 在老年时会出现不同程度的左心衰竭和明显的心肌纤维化, 是良好的研究左心室心肌纤维化的动物模型[6]。中药抗纤维化一直是值得关注和研究的应用领域, 丹参作为传统的中药, 含有重要的心血管活性成分丹参酮ⅡA, 具有较强的抗氧化, 清除自由基, 改善微循环的作用。诸多研究明确表明, 丹参具有能抵抗肝脏的损伤和抗肝纤维化的作用[7]。研究表明, 丹参可能通过降低肾素-血管紧张素-醛固酮系统, 达到预防和逆转纤维化, 改善心内皮细胞的功能[3]。虽然机制并不十分明确, 但丹参降低和逆转心肌纤维化的作用已十分明确。很多降压药物对于老年性顽固性高血压患者作用并不十分遂愿, 因此我们研究了丹参对于老年高血压大鼠的作用。研究表明, 丹参也可以有效地改善并部分逆转左心室的肥厚和心肌的纤维化, 对于心肌血管周围的纤维化尤其明显。

本实验表明, 丹参能显著降低左心室质量指数, 减小心肌细胞的直径和面积, 降低了心肌的间质纤维化和血管周围的纤维化。心肌的病理改变除了要考虑组织解剖学的改变, 也要考虑功能的改善。因此我们也研究了丹参对于左心室功能的影响, 研究表明, 老年SHR呈现了一定程度的心力衰竭, LVEDP平均值大于13 mmHg, 丹参可以有效地降低了LVEDP, 改善左心室的收缩功能。本研究血压测定结果表明, 丹参并未能有效地降低高血压大鼠的血压, 这与郑智[8]等研究类似, 说明丹参并不能改变高血压大鼠的心脏负荷, 但李伟等[9]研究发现白花丹参能够显著降低SHR的血压波动性, 提高压力感受器的敏感性。而血压的波动性与心、脑、肾等器官损伤的程度密切相关, 对于高血压靶器官和并发症的预防和治疗具有重要的作用。

在心肌纤维化的形成过程中, 炎症起了至关重要的作用。炎症细胞可以释放花生四烯酸, 花生四烯酸有三条代谢途径: 经环氧化酶代谢形成前列环素及血栓素A等; 经脂加氧酶代谢产生白三烯及羟基廿碳四烯酸; 经细胞色素P450（CYP）途径代谢为廿烷四烯酸及表氧化廿碳三烯酸。COX-2代谢途径是目前研究最明确的心肌间质纤维化形成的途径[10]。为了证明COX-2途径通路参与了丹参抑制高血压心肌纤维化的作用, 作者进一步使用了特异性抑制剂塞来昔布阻断花生四烯酸环氧化酶信号通路, 观察阻断该途径是否可取消丹参的作用, 研究表明, COX-2抑制剂能部分消除丹参抑制老年SHR的心肌纤维化的作用。作者认为除了COX-2参与丹参抑制心肌纤维化之外, 还有其他途径共同参与了高血压心肌纤维化的途径, 如研究报道基质金属蛋白酶途径、肿瘤坏死因子途径等均参与了高血压的心肌纤维化途径。本研究选取了在丹参抗纤维化作用中发挥重要作用的COX-2途径, 以观察花生四烯酸环氧化酶信号通路在丹参抗心肌纤维化的作用。研究发现, 丹参能够降低COX-2的表达, 说明丹参可能是通过COX-2途径改善老年SHR心肌纤维化的。

[1] Balakumara P, Jagadeeshb G. Multifarious molecular signaling cascades of cardiac hypertrophy: Can the muddy waters be cleared[J]? Pharmacol Res, 2010, 62(5): 365-383.

[2] van Zwieten PA. The influence of antihypertensive drug treatment on the prevention and regression of left ventricular hypertrophy[J]. Cardiovasc Res, 2000, 45(1): 82-91.

[3] 唐忠志, 郑 智, 唐 瑛, 等.丹参对自发性高血压大鼠心肌纤维化的逆转作用及其机制研究[J].华中科技大学学报(医学版), 2002, 31(3): 292-294.

[4] Kurisu S, Ozono R, Oshima T,. Cardiac angiotensin Ⅱ type 2 receptor activates the kinin/NO system and inhibits fibrosis[J]. Hypertension, 2003, 41(1): 99-107.

[5] Gao S, Long CL, Wang RH,. K(ATP) activation prevents progression of cardiac hypertrophy to failure induced by pressure overloadprotecting endothelial function[J]. Cardiovac Res, 2009, 83(3): 444-456.

[6] Xu Q, Chakravorty A, Bathgate RA,. Relaxin therapy reverses large artery remodeling and improves arterial compliance in senescent spontaneously hypertensive rats[J]. Hypertension, 2010, 55(5): 1260-1266.

[7] 陶艳艳, 刘成海. 丹参及其化学成分抗肝纤维化作用机制研究进展[J]. 中西医结合学报, 2004, 2(2):145-148.

[8] 郑 智, 韩少杰, 任大宏. 丹参对自发性高血压大鼠左室肥厚及心脏局部醛固酮的作用[J].中华急诊医学杂志, 2002, 11(1): 22-24.

[9] 李 伟, 王德忠, 朱京涛, 等. 白花丹参对清醒自发性高血压大鼠血压及血压波动性的影响[J]. 中国老年学杂志, 2010, 30(2): 200-202.

[10] Levick SP, Loch DC, Taylor SM,. Arachidonic acid metabolism as a potential mediator of cardiac fibrosis associated with inflammation[J]. J Immunol, 2007, 178(2): 641-646.

（编辑: 周宇红）

Cyclooxygenase-2 pathway in reversion of myocardial fibrosis by Salvia Miltiorrhiza Bge (SMB) in senescent spontaneously hypertensive rats

WANG Jianjun1*, LIU Jie2

(1Cadre¢s Ward, Fuzhou General Hospital, Nanjing Military Command, Fuzhou 350025, China;2Deparment of Cardiology, Union Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China)

To explore the roles of Salvia Miltiorrhiza Bge (SMB) in improving myocardial fibrosis in aged spontaneously hypertensive rats and the possible mechanisms ——cyclooxygenase pathway of arachidonic acid.The 17-month-old SHR rats were given consecutive SMB injection or saline control for 12 weeks, while the age-matched WKY rats were selected as normal control. Meanwhile, celecoxib, the specified arachidonic acid cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, was administrated intragastrically before SMB injection. The blood pressure, hemodynamic index and left ventricular mass index were determined. HE staining and Masson staining were performed to analyze the size of myocardial cells or the level of myocardial fibrosis, as well as left ventricular myocardial expression and activity level of COX-2 protein.Compared with the elderly WKY rats, senescent SHR had higher blood pressure[systolic blood pressure: (171±12)(125±3)mmHg; diastolic blood pressure: (115±9)(87±3)mmHg; mean artery pressure: (139±10)(106±5)mmHg,＜0.05], deterious heart function[LVEDP: (13.9±1.7)(7.6±1.3)mmHg; LVdP/dtmax: (2528±167)(3015±217)mmHg/s;-LVdP/dtmax: (1957±134)(2501±175)mmHg/s,＜0.05], increased left ventricular mass index[(3.45±0.07)(2.23±0.06)mg/g,＜0.05], increased myocardial cells[diameter: (23.5±0.4)(14.3±0.4)μm,＜0.05], severe fibrosis[myocardialinterstitial fibrosis index: (1.66±0.05)%(0.64±0.05)%; myocardial perivascularfibrosis index: (139±9)%(68±7)%,＜0.05], elevated expression[(125.8±7.2)(47.6±3.8),＜0.05] and activity level of myocardial COX-2 protein[(73.9±5.6)(56.7±4.4)kU/g,＜0.05]. Except the systolic blood pressure, other indicators in SMB-treated SHR were significantly reduced. The administration of celecoxib partially abolished the effect of SMB.SMB therapy can reverse myocardial fibrosis in senescent spontaneously hypertensive rats, which may be through cyclooxygenase pathway.

Salvia Miltiorrhiza Bge; spontaneously hypertensive rats; myocardial fibrosis; cyclooxygenase pathway of arachidonic acid

Q463; R541.3

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00032

2011-07-14;

2011-10-10

王建军, Tel: 0591-22859354, E-mail: wjjun1991@sina.com