银杏叶提取物对高同型半胱氨酸血症vWF、Ps、FIB影响的实验研究

马寿宏，顼志兵，罗霜梅，朱 勣，祈丽丽，吴 祎

（1.云南省通海县中医院，云南通海652700； 2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200434）

动脉粥样硬化的发展是一个复杂过程，起始于动脉内皮功能异常，高同型半胱氨酸血症为其触发因素。大量基础和动物实验的表明同型半胱氨酸血症（Hcy）可能通过内皮损伤和内皮功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶的平衡，使机体处于血栓前状态，从而增加了心血管疾病发病的危险性。本文旨在通过研究银杏叶提取物对高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）动物模型血浆Von willebrand′s factor（vWF）、FIB（Fibrinogen）、Ps（P-selectin）浓度、水平的干预作用，阐明银杏叶改善血管内皮功能的机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠51只，体重（142±47）g，由中国科学院上海药物所实验动物中心提供。

1.1.2 实验药物 银杏叶胶囊（百路达），规格：0.2 g×20粒，由上海信谊百路达药业有限公司提供，批号：031204。叶酸片，规格5 mg/片，由上海辛帕斯制药有限公司提供，批号：080801。1%羟甲基纤维素钠溶液（1%CMC）由中国医药集团上海化学试剂公司提供，批号：F20090626。蛋氨酸（Met）由德国德固赛公司提供，批号：15112007W1。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药方法 51只雄性Wistar大鼠随机分为4组，空白对照组12只，模型组13只，叶酸组13只及银杏叶组13只。参照王禄增［1］及Wang G P等［2］等造成大鼠HHcy模型。根据体重计算灌胃量，每周测一次体重。空白对照组予1%羟甲基纤维素钠溶液（CMC）液2 mL灌胃，每天1次，然后给予正常饲料，共8 w。模型组予3%蛋氨酸混悬液（300 mg Met加1 mL 1%CMC液）1.5 mg/g体重灌胃，每天1次，然后给予正常饲料，共8 w。叶酸组予3%蛋氨酸混悬液加叶酸混悬液（1.2 mg叶酸加1 mL 1%CMC液）0.06 mg/g体重灌胃，每日1次，然后给予正常饲料，共8 w。银杏叶组予3%蛋氨酸混悬液加银杏叶混悬液（4 mg银杏叶加1mL 1%CMC液）0.02 mg/g体重灌胃，每日1次，然后给予正常饲料，共8 w。

1.2.2 标本采取 8 w末，所有研究对象均在确诊后进行标本采集。空腹抽取静脉血2 mL，分别置于不抗凝的有机玻璃管内、含有1/10体积0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝液的试管内、含有抑肽酶30 μL、10%乙二胺四乙酸钠盐（EDTA-Na）40 μL的预冷试管中，于4℃冰箱贮存，在4 h内低温离心（10 min，3000 r/min），收集上清液，放于-20℃冰箱贮存备用。

1.2.3 血清Hcy水平检测 采用液相色谱－串联质谱（LC-MS/MS）方法在上海市徐汇区中心医院实验中心检测。本方法批内CV<8.79%，批间CV<6.87%。正常的血清Hcy空腹参考值为5 μmol/L～15 μmol/L。

1.2.4 血浆vWF、Ps检测 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理测定血浆vWF、Ps水平。试剂由上海太阳生物技术公司提供，批号：MB0801，使用SPECTRA max PLUS 384酶标仪测定。

1.2.5 血浆FIB检测 采用免疫浊度法，FIB试剂盒由上海太阳生物技术公司提供，使用UNICO UV 2000紫外可见光光度计进行测定。

1.3 统计学方法

2 结 果

各组血清Hcy水平、血浆vWF、Ps、FIB水平比较，结果见表1。

表1 各组血清Hcy水平、血浆vWF、Ps、FIB水平的比较 （±s）

表1 各组血清Hcy水平、血浆vWF、Ps、FIB水平的比较 （±s）

注:与模型组比较，1）P<0.05，2）P<0.01

组别 n H c y（μ m o l/L） v W F（%) P s（n g/m L) F I B（g/L)空白对照组 10 8.12±2.78 2） 3.55±2.10 2） 0.32±0.06 2） 0.58±0.37 2）模型组 11 100.47±41.68 6.75±2.10 0.47±0.13 1.06±0.41银杏叶组 11 78.27±22.09 1） 4.30±2.00 1） 0.37±0.06 1） 0.64±0.38 2）叶酸组 11 33.34±24.61 2） 4.50±2.84 1） 0.36±0.06 1） 0.80±0.37 2）

从表1可以看出，模型组血清Hcy水平，血浆vWF、Ps、FIB 水平明显高于空白对照组（P<0.01）。用药后叶酸组、银杏叶组血清Hcy水平，血浆vWF、Ps、FIB水平较模型组明显降低，比较有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。用药后银杏叶组血浆vWF、Ps水平与叶酸组比较无统计学意义（P>0.05）。

3 讨 论

大量研究证实，Hcy升高与心血管疾病有关，是心血管疾病的一个独立危险因素［3-6］。基础和动物实验的研究表明，Hcy可能通过以下机制引起动脉粥样硬化和血栓形成。（1）内皮毒素作用：包括自身氧化作用、血管内皮功能紊乱及改变内皮细胞基因表达，诱导细胞凋亡［7-8］。（2）刺激血管平滑肌细胞增生：平滑肌细胞增殖是AS形成过程中的中心环节。Hcy可直接诱导血管平滑肌细胞增殖和胶原的合成［9-11］。Hcy能够增强平滑肌细胞内NF-κB介导的诱生型一氧化氮合酶（iNOS）的合成，促进合成NO。过量的NO促进血管平滑肌细胞从收缩型逆分化为合成型，从而导致平滑肌细胞增生［12］。（3）致血栓作用：Hcy 可导致凝血参数的异常升高，如VIII因子、vWF、FIB、Ps等［13］。Hcy损伤冠状动脉血管内皮细胞引起凝血酶的产生和vWF释放增加，vWF促进血小板黏附、聚集和血栓形成。

Ps既是内皮损伤的一个指标，又是血小板活化的特异性指标。Ps介导血小板黏附于内皮细胞及血小板－中性粒细胞、血小板－单核细胞连接，启动血栓形成过程［14-15］。冯维尔布兰德因子（Von willebrand′s factor，vWF，血管性血友病因子）由血管内皮细胞和巨噬细胞合成分泌的一种多聚糖蛋白，vWF水平在某种程度上反映了内皮细胞的功能状态和结构完整与否。通过其配体糖蛋白Ib（GPIb）和糖蛋白IIb／IIIa介导血小板黏附和聚集，形成稳定的血小板纤维蛋白血栓。FIB水平增高可加速动脉粥样硬化损伤及血栓形成［16］。

本实验观察到模型组血清Hcy较空白对照组明显升高（P<0.05），血浆 vWF、Ps、FIB 水平也较空白对照组升高（P<0.05）；且血清Hcy水平与血浆 vWF、Ps、FIB 呈正相关（P<0.05），与文献报道相似［2，16］，进一步证实了过量的蛋氨酸可造成HHcy，HHcy可造成内皮功能紊乱，血浆vWF、Ps、FIB水平升高，血液处于血栓前状态，促使动脉粥样硬化和血栓形成。

晚近国内外对银杏叶提取物（GBE）的有效成分的活性及作用机制做了大量的基础和动物实验研究，证实银杏叶具有广泛的药理作用，如拮抗血小板活化因子、抗氧化作用、清除自由基、改善血管内皮舒缩功能、减轻平滑肌细胞的增殖，影响离子通道和信号传导、扩张血管，降血脂，改善血液流变学等作用［17-18］。

本研究观察GBE降低血清Hcy水平的作用，结果显示模型组血清Hcy水平较空白对照组升高（P<0.05）。用药后叶酸组、银杏叶组血清Hcy水平明显降低，与模型组比较有明显差别（P<0.05），表明GBE有降低血清Hcy水平的作用。

观察GBE对HHcy血浆vWF、Ps、FIB水平的影响，结果显示模型组血浆vWF、Ps、FIB水平明显高于空白对照组（P<0.01）。用药后银杏叶组、叶酸组血浆vWF、Ps、FIB水平降低，与模型组比较有显著性差异（P<0.05）。研究表明GBE可能通过降低HHcy血浆vWF、Ps、FIB水平，降低血液黏度，减少血栓形成，改善血管内皮功能，延缓动脉粥样硬化的进程和血栓形成。

［1］王禄增，张梅英，季勇，等.Wistar大鼠实验性动脉粥样硬化的研究［J］.中国实验动物学报，2002，10（2）：113-115.

［2］Wang G P，Connie W H Woo，Fion L Sung，et al.Increased monocyte adhesion to aortic endothelium in rats with hyperhomocysteinemia：role of chemokine and adhesion molecules［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22（3）：1777-1783.

［3］Jarosz A，Nowicka G.C-reactive protein and homocysteine as risk factors of atherosclerosis［J］.Przegl Lek，2008，65（6）：268-72.

［4］Kalra D K.Homocysteine and cardiovascular disease［J］.Curr Atheroscler Rep，2004，6（2）：101-106.

［5］Liao D，Yang X，Wang H.Hyperhomocysteinemia and high-density lipoprotein metabolism in cardiovascular disease［J］.Clin Chem Lab Med，2007，45（12）：1652-1659.

［6］Thomas N E，Cooper S M，Williams S R，et al.Fibrinogen，homocysteine，and C-reactive protein concentrations relative to sex and socioeconomic status in British young people［J］.Am J Hum Biol，2005，17（6）：809-813.

［7］Weiss N，Heydrick S J，Postea O，et al.Influence of hyperhomocysteinemia on the cellular redox state-impact on homocysteine-induced endothelial dysfunction［J］.Clin Chem Lab Med，2003，41（11）：1455-1461.

［8］Skurk C，Walsh K.Death receptor induced apoptosis：a new mechanism of homocysteine-mediated endothelial cell cytotoxicity［J］.Hypertension，2004，43（6）：1208-1213.

［9］Majors A，Ehrhart L A，Pezacka E H.Homocysteine as a risk factor for vascular disease：Enhanced collagen production and accumulation by smooth muscle cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17（10）：2074-2081.

［10］Chen C，Halkos M E，Surowiec S M，et al.Effects of homocysteine on smooth muscle cell proliferation in both cell culture and artery perfusion culture models［J］.J Surg Res，2000，88（1）：26-33.

［11］陈小莉，杨庆，蔡东联，等.同型半胱氨酸促进血管平滑肌细胞增生的实验研究［J］.营养学报，2002，24（4）：385-388.

［12］Welch G N，Upchurch G R Jr，Farivar RS，et al.Homocysteineinduced nitric oxide production in vascular smooth-muscle cells by NF-kappa B-dependent transcriptional activation of Nos2［J］.Proc Assoc Am Physicians，1998，110（1）：22-31.

［13］Di Minno G，Coppola A，Mancini F P，et al.Homocysteine，platelet function and thrombosis［J］.Haematologica，1999，84（Suppl）：61-63.

［14］Amrani D L，Stojanovic L，Mosesson M N，et al.Development of a whole platelet ELISA to detect circulating activated platelets［J］.J Lab Clin Med，1995，126（6）：603-611.

［15］胡高频，张文秀.P－选择素与心肌缺血再灌注损伤［J］.国外医学·心血管疾病分册，2001，28（2）：26-29.

［16］Di Minno G，Coppola A，Mancini F P，et al.Homocysteine，platelet function and thrombosis［J］.Haematologica，1999，84（Suppl）：61-63.

［17］Zhou W，Chai H，Lin P H，et al.Clinical use and molecular mechanisms of action of extract of Ginkgo biloba leaves in cardiovascular diseases［J］.Cardiovasc Drug Rev，2004，22（4）：309-319.

［18］高治平.银杏叶提取物对小鼠长期毒性的实验研究［J］.山西中医学院学报，2006，7（5）：22-23.