麸炒枳壳配方颗粒特征图谱研究

徐以亮

(江阴天江药业有限公司，江苏 江阴 214434)

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL．及其栽培变种的干燥未成熟果实，具有理气宽中、行滞消胀之功效，用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化等症。2010年版《中国药典(一部)》中主要采用柚皮苷和新橙皮苷的含量来评价枳壳药材的质量[1]。有关枳壳药材及饮片的质量控制方法，已有相关文献报道[2－4]。麸炒枳壳配方颗粒为枳壳药材经现代制剂技术制成的颗粒剂，为有效控制其内在质量，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法对11批麸炒枳壳配方颗粒进行测定，初步建立了麸炒枳壳配方颗粒HPLC特征图谱，共确定4个特征峰，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);AT－330型柱温箱(天津奥特赛恩斯科学仪器有限公司);超声清洗机(无锡超声电子设备厂);电子天平(瑞士梅特勒公司)。柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110722－200309);新橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为111857－201102);麸炒枳壳配方颗粒(江阴天江药业有限公司，批号分别为 0710142、0712057、0805132、0807181、0809038、0901062、0904034、0909004、0912080、1008088、1010079，分别编号为 S1 ～S11);乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Megres5－C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)和4%冰醋酸水溶液(B)，二元梯度洗脱65 min，0～5 min时，5% ～10%A(V/V)，5～20 min时，10% ～35%A(V/V)，20～40 min时，35% ～65%A(V/V)，40～60 min 时，65% ～100%A(V/V)，60～65 min时，100% ～5%A(V/V);流速:1．0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:280 nm;进样量:10 μL。在此色谱条件下，对照品及样品中各色谱峰均获得了较好分离(图1)。

图1 高效液相色谱图

2．2 溶液配制

精密称取柚皮苷对照品6 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成柚皮苷对照品溶液。精密称取新橙皮苷对照品2．5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成橙皮苷对照品溶液。精密称取预先粉碎的麸炒枳壳配方颗粒0．1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0．45 μm滤膜，即得供试品溶液。

2．3 方法学考察

精密度试验:取同一批样品(批号为1008088)，按2．2项下方法制备成供试液，进样5次。以3号峰为参照峰，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，相似度大于0．997 8，RSD低于3%(n=5)，符合中药高效液相指纹图谱的检验要求。

重现性试验:取同一批样品(批号为1008088)共5份，分别制备供试品溶液并依法测定。以3号峰为参照峰，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，相似度大于0．99，RSD低于3%(n=5)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在制备后0，6，12，24，48 h时进样测定。以3号峰为参照峰，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰的相对保留时间和相对峰面积亦基本一致，相似度大于0．99，RSD低于3%(n=5)，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2．4 样品测定

分别按2．2项下方法制备供试品溶液并测定11批样品的HPLC图谱。比较记录的色谱图，并将处理结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”进行分析。

2．5 高效液相特征图谱的构建

特征峰确定:采用相对保留时间标定共有指纹峰，即以柚皮苷为参照物(S)，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间相比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算11批样品特征图谱中各色谱峰的相对保留时间和峰面积，其中4个色谱峰为11批样品所共有，其特征峰的相对保留时间为峰 1(0．90)、峰 2(0．97)、峰 3(1．00)、峰 4(1．05)。峰 3 为柚皮苷(S)，峰4为新橙皮苷。因此，标定这4个色谱峰为共有特征峰(图 2)。

图2 11批麸炒枳壳配方颗粒的共有特征峰

特征图谱相似度评价:将所得到的色谱数据导入国家药典委员会指定的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”，设定参照图谱，采用多点校正将谱峰自动匹配，然后生成对照图谱，进行相似度评价，结果见图3和表1。从表1中可以看出，11批样品的相似度均在0．95以上，说明该11批枳壳配方颗粒的差别很小。

图3 11批麸炒枳壳配方颗粒的特征图谱

与枳壳药材的相关性验证:将麸炒枳壳配方颗粒的特征图谱与枳壳药材的水煎液的液相图谱进行比较(图4)。结果表明，麸炒枳壳配方颗粒中的特征峰与枳壳药材水煎液色谱峰能够一一对应。

3 讨论

供试液制备过程中，曾采用不同溶剂(甲醇、50%甲醇、70%乙醇、稀乙醇)进行比较，结果以甲醇和稀乙醇超声提取30 min所得溶液的色谱峰较多。通过对主要色谱峰理论板数的比较，采用甲醇提取所得供试液的分离效果优于稀乙醇提取所得供试液，因此采用甲醇作为提取溶剂。

表1 11批麸炒枳壳配方颗粒样品的相似度

图4 麸炒枳壳配方颗粒与枳壳药材相关性验证图

采用DAD检测器记录麸炒枳壳配方颗粒样品溶液在190～400 nm的3D吸收图，发现检测波长为280 nm时谱图中出现的色谱峰最多，且分离度良好，因此选择280 nm作为检测波长。

筛选了乙腈－水、乙腈－0．1%冰醋酸、甲醇－0．1%冰醋酸、乙腈－4%冰醋酸、乙腈－1%冰醋酸、乙腈－0．1%磷酸等系统组成的流动相，最终确定以乙腈－4%冰醋酸水溶液进行梯度洗脱，所得基线平稳，色谱峰峰型，分离度高。比较了Megres5－C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)、Lichrospher－C18柱(200 mm ×4．6 mm，5 μm)及 ZORBAX Eclipse XDB －C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)的分离效果，结果前者分离效果理想。此外，还考察了不同流速及柱温对分离效果的影响，结果表明，柱温为30℃，流速为0．8 mL/min时样品的分离效果较好。

从所得特征图谱的分析结果来看，本试验各批样品的相似度较高，均一性较好。各共有峰的相对保留时间较稳定，具有专属性，可用于鉴别麸炒枳壳配方颗粒的真伪，为今后麸炒枳壳配方颗粒生产过程的质量控制提供了检测依据。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京:中国医药科技出版社，2010:229－230．

[2]王发英，徐 欢，杨武亮，等．枳壳质量标准研究[J]．中成药，2009，31(12):1 897－1 901．

[3]王少军，曹 君，杨武亮，等．枳壳生饮片的HPLC指纹图谱研究[J]．中草药，2005，36(11):1 646 －1 648．

[4]赵 宇，谢培山，梁逸曾，等．中药枳壳HPLC指纹图谱分析及化学模式识别分类研究[J]．中国药学杂志，2005，40(11):812－815．