人miR-205真核表达载体的构建及鉴定

吴义高，肖 戈，徐文清，黄 福，胡卫列，王 尉

(1南方医科大学研究生学院，广州510515;2广州军区广州总医院泌尿外科研究所)

国内外研究发现，miR-205参与了细胞的增殖、分化、凋亡及侵袭等，与恶性肿瘤发生、发展密切相关［1］。我们前期研究发现在肾上腺皮质癌(ACC)中miR-205低表达。但miR-205在ACC中的作用机制尚不清楚，且目前国内外鲜见miR-205与ACC关系的报道。ACC恶性程度高，侵袭性强，约40%在诊断时已出现远处转移，其早期诊断与肾上腺良性肿瘤鉴别困难，其治疗仍以根治手术为主，缺乏有效的药物治疗，术后复发率高，预后差［2］。2011年9月～2012年5月我们通过构建miR-205真核表达载体，转染SW-13细胞后使其获得miR-205的稳定高表达，从而为miR-205靶点验证和功能研究提供强有力的实验基础，为ACC临床诊疗提供一种可能的新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料 ACC细胞SW-13购自上海细胞所; pcDNA3.1(+)为南方医科大学肿瘤研究所保存; E.coli DH5α感受态细胞、Lipofectamine 2000 Reagent购自Invitrogen公司;G418、LATaq聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTPMixture、HindⅢ、XhoⅠ限制性内切酶、DNA marker、胶回收试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix均为TaKaRa公司产品;基因组DNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒为Promega公司产品;IL-15培养基及胎牛血清均由广州威佳公司提供。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物设计与合成 miRbase数据库中获得miR-205前体pre-miR-205的序列(AAAGATCCTCAGACAATCCATGTGCTTCTCTTGTCCTTCATTCC ACCGGAGTCTGTCTCATACCCAACCAGATTTCAGTG GAGTGAAGTTCAGGAGGCATGGAGCTGACA)，在premiR-205的颈环序列上下游各延伸200 bp左右设计引物调取pre-miR-205基因组序列，并在引物上引入末端的保护碱基、HindⅢ、XhoⅠ的酶切位点，引物由上海生工生物公司合成。引物序列为:miR-205 HindⅢ F:5'-CCC AAGCTTCTGGGTGGCTGTTTTGAAAAC-3';miR-205 XhoⅠR:5'-CCGCTCGAGGA AGCACGCACACTCCAGATG-3'。

1.2.2 miR-205真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205的构建与鉴定 按DNA抽提试剂盒说明书提取肾上腺皮质细胞SW-13基因组DNA，用预先设计引物进行PCR扩增，反应条件为94℃5 min预变性，94℃ 20 s，55℃20 s，72℃ 35 s经过30个循环，再72℃扩增5 min后于16℃保存;PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，使用DNA凝胶回收试剂盒回收获得目的产物。将回收的目的产物用HindⅢ、XhoⅠ限制性内切酶酶切，获得目的基因片段。pcDNA3.1(+)质粒经HindⅢ、XhoⅠ双酶切后回收线性化空载体。取2 μL回收的线性化空载体与3 μL的目的基因片段，在T4 DNA Ligase作用下，16℃连接2 h;连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后，均匀涂于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃过夜培养。使用质粒提取纯化试剂盒进行质粒提取，取3 mL提取质粒在37℃下HindⅢ、XhoⅠ酶切2 h，酶切产物在含1%琼脂糖凝胶电泳分离，UVP凝胶成像系统成像;最后将酶切鉴定正确的克隆送华大基因公司测序，无内毒素质粒提取试剂盒抽提测序正确克隆的质粒，－20℃冰箱中保存备用。

1.2.3 SW-13细胞转染pcDNA3.1(+)-miR-205和稳定克隆的筛选 转染前1 d对SW-13细胞株进行传代，使其汇合度为60%～70%，转染采用Lipofectamine 2000试剂，转染时使用Opti-MEM培养基。实验共分3组:①pcDNA3.1(+)空载体组;②pcDNA3.1(+)-miR-205重组质粒组;③未转染组。每组设3个复孔。转染使用24孔板，每孔加入1 μg质粒，稀释到400 μL Opti-MEM培养基为A液，取2 μL Lipofectamine 2000溶解于100 μL Opti-MEM培养基为B液，B液混合5 min后，A液和B液混合，静止20 min后加到细胞培养板中，以上操作是每孔用量。孵育4 h后换为10%FBS的IL-15完全培养基。转染24 h后，换为含G418(200 mg/L)的10% FBS的IL-15完全培养基，每3 d换1次液，2周后未转染组SW-13细胞全部死亡，转染组仍有细胞存活，继续按上述方法压力筛3周后，获得稳定细胞系，扩大培养。

1.2.4 RT-qPCR验证SW-13细胞转染pcDNA3.1 (+)-miR-205的表达情况 转染pcDNA3.1(+)-miR-205细胞组、转染pcDNA3.1(+)细胞组及未转染组分别进行培养，提取总RNA，纯度检测:OD260/ OD280的比值大于1.8，在反转录酶作用下反转录形成得第一链cDNA为模板，由实时定量荧光miRNA特异引物进行 PCR反应，使用 SYBR Green PCR Master Mix，反应条件:95℃变性15 s，65℃退火15 s，72℃荧光检测32 s，重复40个循环。60～95℃绘制溶解曲线，每个样品重复3次。PCR反应以U6为内参照，其引物为:U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6-R:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'; miR-205引物序列为:pre-miR-205 F:5'-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCCACCGGAG-3'，pre-miR-205 R:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。

2 结果

2.1 PCR扩增基因组DNA中miR-205片段 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在553 bp处可见一特异扩增条带，扩增条带在Marker 500 bp和750 bp之间，产物的大小与NCBI数据库检索的miR-205大小一致，证明miR-205目的基因已扩增出来(封二图3)。

2.2 重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-205的双酶切鉴定 重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-205经HindⅢ、XhoⅠ双酶切后，可见一大一小两条扩增带，其中在553 bp的位置出现目的条带(封二图4)，说明筛到的克隆为阳性克隆，送质粒去测序。

2.3 重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-205的测序鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-205经酶切分析为正确的克隆，基因测序生物公司的测序结果与miRbase中的序列一致。Sequence 0、Sequence 1分别为pre-miR-205、pcDNA3.1(+)-miR-205序列，经Megalign比对软件证实了构建的重组质粒正确(封二图5)。

2.4 RT-qPCR检测miR-205的表达差异 pcDNA3.1(+)转染组与未转染组相比，两者miR-205的表达无明显差异，而pcDNA3.1(+)-miR-205转染组与 pcDNA3.1(+)转染组相比，pcDNA3.1 (+)-miR-205转染组miR-205的表达升高约32倍(P＜0.01)，表明重组表达载体 pcDNA3.1(+)-miR-205能够在SW-13细胞中高水平表达miR-205。

3 讨论

在不同种属中，miR-205都是一种高度保守的miRNA。在保护小鼠及红鳍东水鲀基因序列的基础上，miR-205通过计算机方法首次被预测出来［3］，随后miR-205的表达在斑马鱼及人类体内得到确认［4，5］。miR-205基因定位于 1号染色体 LOC 642587位点第二内含子上。miR-205在斑马鱼上皮表达［6］，在人类乳腺癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤细胞中明显低表达［7］。

研究miRNA功能较为直接的是利用遗传学方法。早先的miRNA及功能都是通过正向遗传学方法鉴定的，即利用突变表形寻找遗传位点，再克隆基因［8］。反向遗传学则是通过从已知miRNA出发，通过异常表达产生的表型，从而获知miRNA功能。利用反向遗传学方法，人们发现miR-181促进骨髓造血肝细胞B细胞分化［9］，miR-375调控胰岛素分泌［10］。反向遗传学的核心是过表达技术，构建miRNA真核表达载体是一种较常用过表达技术，其miRNA能发挥更持久的作用。构建miRNA真核表达载体的方法有:①利用统一表达框的miRNA过表达技术［11］;②利用人类基因组DNA为模板，扩增出miRNA的前体序列后克隆到真核表达载体［12］，构建成能够过表达miRNA的真核重组载体。构建miRNA的真核表达载体能较好地模拟体内miRNA的自然表达过程，能够更真实地体现miRNA的生物学功能。

本研究我们采用的真核表达载体pcDNA3.1 (+)，该载体含CMV启动子，Amp、Neo抗性基因及polyA加尾信号等，并且能够在大多数哺乳动物细胞中稳定表达［13］。我们将重组质粒 pcDNA3.1 (+)-miR-205转染到SW-13细胞，细胞培养过程中始终维持G418筛选压力，获得质粒整合进基因组DNA的单克隆细胞。为了检测重组质粒pcDNA3.1 (+)-miR-205在筛选获得的SW-13细胞中是否能够稳定表达miR-205，我们通过RT-qPCR技术进行检测，结果显示miR-205在SW-13细胞内较高水平表达，说明重组质粒载体pcDNA3.1(+)-miR-205在SW-13细胞系中筛选成功。这为进一步研究miR-205在肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭浸润所起的作用提供研究基础，为ACC的诊疗提供一种可能的新的方法。

［1］Carrington JC，Ambros V.Role of microRNAs in plant and animal development［J］.Science，2003，301(5631):336-338.

［2］Soon PS，McDonald KL，Robinson BG，et al.Molecular markers and the pathogenesis of adrenocortical cancer［J］.Oncologist，2008，13(5):548-561.

［3］Lim LP，Glasner ME，Yekta S，et al.Vertebrate microRNA genes［J］.Science，2003，299(5612):1540.

［4］Wienholds E，Kloosterman WP，Miska E，et al.MicroRNA expression in zebrafish embryonic development［J］.Science，2005，309 (5732):310-311.

［5］Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing［J］.Cell，2007，129(7):1401-1414.

［6］Ason B，Darnell DK，Wittbrodt B，et al.Differences in vertebrate microRNA expression［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 (39):14385-14389.

［7］Shingara J，Keiger K，Shelton J，et al.An optimized isolation and labeling platform for accurate microRNA expression profiling［J］.RNA，2005，11(9):1461-1470.

［8］Iwai N，Naraba H.Polymorphisms in human pre-miRNAs［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，331(4):1439-1444.

［9］Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation［J］.Science，2004，303(5654):83-86.

［10］Poy MN，Eliasson L，Krutzfeldt J，et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion［J］.Nature，2004，432 (7014):226-230.

［11］Wu J，Bonsra AN，Du G.pSM155 and pSM30 vectors for miRNA and shRNA expression［J］.Methods Mol Biol，2009，487: 205-219.

［12］Shan ZX，Lin QX，Deng CY，et al.Plasmid-mediated miRNA-1-2 specifically inhibits Hand2 protein expression in H9C2 cells［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2008，28(9):1559-1561，1567.

［13］吴文新，付玉华，沈玉光，等.miR-181a真核表达载体的构建及鉴定［J］.广东医学，2011，32(2):149-151.