树突状细胞在膀胱癌免疫治疗中的应用进展

(山东大学附属千佛山医院，济南250014)

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤之一［1］，治疗后容易复发。膀胱癌术后辅助治疗抑制肿瘤复发是膀胱癌治疗的重要组成部分。在机体对肿瘤细胞的免疫应答过程中，T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中起主导作用，但T细胞的致敏、激活和扩增均需依赖于抗原递呈细胞(APC)递呈相应的抗原多肽并提供共刺激信号，其中树突状细胞(DC)是机体内功能最强的抗原递呈细胞［2］，能够激活初始和静息T细胞，诱导机体产生肿瘤特异、持久的主动免疫应答。近年来有学者将DC用于膀胱癌的免疫治疗，取得了较多研究进展。现综述如下。

1 DC的生物学特性及功能

DC广泛分布于人体内除大脑外的组织器官内，包括淋巴和非淋巴器官。DC在组织中含量极低，不足人外周血单个核细胞(PBMC)的1%，并且大部分DC处于未成熟状态。未成熟DC具有很强的摄取、加工抗原和迁移能力，摄取抗原后的DC通过淋巴管进入局部淋巴结，在多种炎性细胞因子刺激作用下逐渐成熟，在这个过程中DC呈递抗原的能力逐渐加强。成熟DC将处理过的抗原肽-MHCⅠ类复合物和抗原肽MHCⅡ类复合物递呈至细胞表面供T细胞识别，启动MHCⅠ类限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应和MHCⅡ类限制性辅助性T细胞(Th)反应，诱导产生抗原特异性CTL，从而启动免疫应答［3］。

2 膀胱肿瘤可能的免疫逃逸机制

肿瘤细胞的免疫逃逸机制较为复杂，主要有两方面:一是肿瘤细胞具有抗原调控能力，致使肿瘤抗原不能有效递呈，T细胞介导的免疫不能被有效激活，或因缺乏共刺激信号而导致T细胞失能。另一方面，则由于荷瘤宿主DC数量少或功能缺陷，无法有效递呈抗原激活T细胞以识别和杀伤肿瘤细胞。

Troy等［4］检测膀胱癌组织中的浸润性 DC(TiDC)发现肿瘤组织中DC数量较正常组织减少，且绝大多数为静息状态的DC，而表达CD+83的DC极少，仅占DC数量的5% ～10%。国内闫东等［5］检测明膀胱癌患者外周血中DC发现，DC数量少且多数处于不成熟状态。这些研究提示荷瘤宿主DC的异常破坏了机体的局部免疫监视系统与泌尿系肿瘤的发生有密切关系，由于DC数量少及功能缺陷使得肿瘤抗原无法被有效递呈，加之DC表面共刺激分子和黏附分子的低表达或不表达，不能提供激活T细胞所需的共刺激信号，因而无法有效诱导肿瘤特异性CTL反应，最终导致肿瘤的免疫逃逸。

3 DC在膀胱癌免疫治疗中的应用

鉴于DC在抗肿瘤免疫中有重要作用，而其功能缺陷是泌尿系肿瘤发生的主要原因之一，因而临床上可以通过使用DC疫苗或者其他手段增加肿瘤内成熟DC数量与活性，从而有效地递呈肿瘤抗原，提高机体对肿瘤的免疫杀伤力，这成为膀胱肿瘤免疫治疗新的切入点。

已证实从人的外周血PBMC可诱导、培养出成熟DC［6，7］。有学者者以此为基础，从荷瘤宿主外周血获取PBMC，用粒细胞集落刺激因子、人重组IL-4经培养1周后，即可获得大量成熟DC疫苗，其表面高水平表达MHCⅠ、Ⅱ类分子，递呈丰富的肿瘤抗原肽，而共刺激分子、黏附分子如 B7-1、B7-2、CD40等表达亦明显上调，可为T细胞的激活充分提供第1、2活化信号。目前DC疫苗制造方法主要包括肿瘤细胞融合DC、肿瘤抗原致敏DC、肿瘤细胞提取物致敏DC、肿瘤细胞RNA致敏DC以及基因转染的DC等。

3.1 肿瘤细胞直接融合DC 20世纪70年代发展起来的融合技术及其快速发展，使DC融合疫苗的制备成为DC研究新热点。DC融合疫苗在国外已用于多种肿瘤的研究，主要是黑色素瘤、前列腺癌、骨髓瘤、乳腺癌［8，9］，而且已经取得一定的成果，有的已经用于临床试验，融合技术也从简单的聚乙二醇(PEG)物理方法发展到电融合方法［10］。前期的研究表明，利用聚乙二醇、电穿孔等技术将DC与肿瘤细胞融合制备的杂交细胞瘤苗，可表达DC的MHCⅠ、Ⅱ类分子和黏附、共刺激分子，又能表达肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，且杂交后仍保持DC的吞噬及抗原递呈能力，从而提高了肿瘤抗原的免疫原性。但是，可能由于肿瘤患者个体差异，临床疗效不是很理想［11］。

3.2 肿瘤特异性抗原致敏DC 肿瘤特异性抗原致敏DC是目前研究最多的抗肿瘤免疫方法之一。应用肿瘤特异性抗原或抗原多肽在体外冲击DC，使其致敏，然后将其回输或免疫接种到荷瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，能够显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，从而产生保护性免疫反应，而且能够治疗已建立的荷瘤宿主以及肿瘤患者。Nishiyama等［12］将MAGE-3抗原肽(IMPKAGLLI)与HLA-A24特异性结合后，冲击HLA-A24阳性膀胱癌患者自身DC后发现，DC对表达MAGE-3的膀胱癌细胞株FY的杀瘤效应明显增强。肿瘤特异性抗原致敏DC的优点为靶向性好，抗原浓度大，具有高度特异性，且不发生自身免疫反应。

3.3 肿瘤细胞提取物致敏DC 利用传统的方法包括超声破碎、反复冻融、诱导细胞凋亡等处理完整细胞制备的肿瘤细胞提取物致敏DC，无需了解肿瘤相关抗原的特征及相关抗原表位，且用多种不同的肿瘤抗原冲击DC，可诱导针对不同抗原决定簇的CTL克隆，减少了肿瘤对单一抗原表位发生免疫逃逸的可能，保证了肿瘤免疫的全面有效性，有实用价值。国内王江平等［13］研究发现膀胱癌细胞裂解物致敏的DC能诱导产生显著的T淋巴细胞增殖，在体外具有明显的抑癌效应。肿瘤细胞提取物致敏DC在递呈肿瘤细胞蛋白提取物的过程中，有可能同时递呈破碎的肿瘤细胞内部的一些自身抗原，有诱发自身免疫疾病的潜在危险。

3.4 肿瘤细胞RNA致敏DC 随着RNA扩增技术的成熟，将肿瘤细胞的RNA扩增后导入DC，代替肿瘤抗原刺激DC，建立肿瘤细胞RNA致敏DC的抗肿瘤免疫治疗。由于RNA可以从有限的肿瘤组织中提取，并可通过PCR体外扩增得到足够数量的RNA，这种方法解决了抗原制备时肿瘤细胞来源有限的问题，并且不需知道肿瘤抗原的确切成分，还可以通过差异筛选法获得肿瘤细胞特异性表达的肿瘤mRNA，用其刺激DC，可避免自身抗原刺激DC诱发自身免疫疾病的危险，而且RNA只在宿主细胞的胞质中表达，且其半衰期短，较安全。

Schmitt等［14］将膀胱癌患者肿瘤细胞来源的mRNA转染患者自身DC，发现转染后的DC能有效激活、识别自体肿瘤细胞的T细胞，当效靶比为50∶1时，其细胞毒性约为26%。原本在体外不能杀灭自体肿瘤细胞的肿瘤浸润淋巴细胞(TiLC)，经转染后DC刺激，可诱导35.7%的肿瘤细胞裂解。

此方法制备的DC疫苗存在的缺陷为稳定性差、易降解和功效低，并且RNA转染的最佳时机、剂量以及是否需要使用载体，尚需要进一步加以验证。

3.5 肿瘤、细胞因子、共刺激分子和黏附分子基因转染的DC疫苗 利用重组腺病毒、脂质体或裸DNA等将编码肿瘤抗原的基因转染DC，使DC能持续加工和呈递抗原多肽，并将肿瘤相关抗原的多个表位与MHC分子相结合表达于细胞表面，从而能更有效地激活 T 细胞［15，16］。国内孙璇等［17］在体外磁场的作用下将人黏蛋白1基因(MUC1/Y)转染DC后发现，可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y阳性膀胱癌的免疫效应。将细胞因子GM-CSF、IL-12、IL-4、FLt3L等基因转入DC，可提高初级的肿瘤抗原特异性T细胞反应，从而促进机体内的抗肿瘤免疫［18，19］。另外由于肿瘤细胞大多缺乏共刺激分子和黏附分子往往不能提供T细胞活化所需的第二信号。使用共刺激分子和黏附分子修饰DC，可打破机体对肿瘤的免疫耐受状态，增强抗肿瘤免疫反应［20］。

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