微透析取样技术在中药体内分析中的应用研究进展

季亚军

中药自身的特点决定了其体内分布、代谢过程的特殊性与复杂性，因此，仅靠一种类型的分析技术并不能满足中药分析的要求，而需采用联用多种分析技术进行综合分析。微透析(Microdialysis，MD)探针技术是近年来兴起的生物活体取样技术。它利用透析的原理，可在清醒、自由活动的动物身上进行原位、实时、在线取样［1］。近年来，微透析探针与色谱分析仪器联用，为中药体内分析开辟了高效精确的新途径。本文介绍微透析取样技术的原理、组成、探针类型、特点以及在体微透析取样技术在中药体内分析中的应用，为药学工作者提供中药体内分析方法的新思路。

1 微透析取样技术的基本原理

微透析取样技术的原理是将探针植入生物体内，同时，开动体外微量灌流泵，使灌流液流经探针头部的半透膜;可通过半透膜的小分子药物顺浓度差扩散进入透析管，并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，灌流液和组织液中的待测药物达到动态平衡，从而达到活体组织取样的目的。

2 微透析取样技术的组成

微透析装置的组成并不复杂，主要包括探针、连接导管、微量灌流泵、灌流液、样品收集器及定量分析仪器。微量灌流泵以注射泵为佳，可避免恒流泵和蠕动泵的波动，流速一般为1～5μL/min。灌流液应选用细胞外液的等渗液，其中也会加入适宜的改性剂(如β-环糊精)，以提高探针的回收率［2］。探针是微透析装置的核心部件，微透析的探针通常由一管式的再生纤维或聚碳酸酯透析膜固定于由钢、石英毛细管或塑料制成的双层套管构成，其直径一般为250～350μm。探针有多种形式，按其构造大致可分为4类［3］:①主要用于脑部的同心圆式探针(Concentric cannula probe);②主要用于血管的柔性探针(Flexible probe);③主要用于肌肉、皮肤、肿瘤、肝等外周组织的线性探针(Linear probe);④主要用于胆管的分流探针(Shunt probe)。探针的类型、内径大小及切割分子量的大小可根据实际应用的要求选定。

3 微透析取样技术的特点

与传统的在体分析方法比较，微透析取样技术有以下优点:①连续性采样:传统在体分析方法中，样品收集多采用侵入性的方式，此种方式受限于实验动物(如鼠)的体液量，若采样过于密集，可导致动物的低血容量;若取样时间点不足，无法反映出药物在体内的连续变化过程，进而影响实验的客观性。微透析技术的取样量很小，不会导致实验动物的体液流失过多，又可连续性地收集样品，可“实时”反映药物在体内的连续变化过程。②多部位采样:可将微透析探针植入实验动物的血管、肝脏、胆管、脑部等部位［4］，以扩大体内分析的范围，获取更多的药物动力学信息。此外，微透析探针还能植入肿瘤组织中，以检测其中药物浓度的变化［5］。③无需样品前处理:传统在体分析方法多需要样品前处理，如蛋白质沉淀、液液萃取等。而微透析取样技术对分子量大小有一定的要求，因此，样品相对干净，除免去繁杂的处理步骤，还减少了样品前处理带来的人为误差和杂质对分析的干扰。④自动筛选非结合型的游离态药物:只有游离态的药物才能到达细胞，并与其结合，产生进一步的药理作用。体内分析的目的是检测游离态药物的浓度。传统的在体分析方法通常无法将结合型与非结合型药物分开，而结合型药物通常无法透过微透析装置中的半透膜。因此，微透析取样技术得到的样品皆为游离态药物，而能更真实地反映药物在体内的药理活性。

当然，微透析取样技术也有其局限性，一是微透析取样是在非平衡条件下进行的，所测得的透析液中，化合物浓度只是探针周围样品基质中实际浓度的一部分，而非组织中的药物浓度。虽然可用探针的回收率来修正测定值，但不够完善，如脂溶性药物会吸附在探针上，进而影响回收率的测定［3］。二是微透析技术要求探头必须准确插在同一取样部位，因此，不适合对很小的脑内神经核团采样。另外，由于微透析膜体积小，灌流液的流速低，想以“秒”为单位进行动态观察较难实施。

4 微透析取样技术在中药体内分析中的应用

4.1 在脑内分析中的应用 微透析技术最初主要用于研究药物在脑中的分布和转运［6］。一方面，由于微透析技术开发的目的是用于神经化学方面的研究;另外，早期微透析探针的刚性设计只适于脑内放置。用微透析取样技术测定脑内药物浓度比其他测定方法有明显的优势，如具有较好的时间和空间分辨性，选择性好，且不受代谢物的干扰。利用微透析技术测定脑中中药有效成分的含量或考察中药的药理作用的研究也早已开展。Tsai等［7］应用微透析探针对黄芩素在海马区中的药物动力学进行研究，同时使用环孢霉素A考察P-糖蛋白对黄芩素代谢的影响。张群林等［8］应用微透析-液相色谱-化学发光法测定大鼠脑组织中丹参酚类化合物的浓度，实现了脑组织中游离丹参素浓度的动态监测，具有高选择性和高灵敏度等优点。吕允凤等［9］应用微透析技术和质谱法测定川芎嗪对大鼠脑内乙酰胆碱释放量的影响，方法学考察显示，该法能够准确反映药物对大鼠脑内乙酰胆碱释放量的影响，与传统方法相比，具有明显优势。刘培等［10］应用微透析结合HPLC-ECD快速测定正常和原发性痛经模型大鼠下丘脑中的5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)含量。微透析样品中5-HIAA的检测限和定量限分别是1.5、5.0 ng/mL。痛经模型大鼠的5-HIAA的含量比正常对照组显著增加，表明原发性痛经可导致5-HIAA增加。而经过香附四物汤治疗后，5-HIAA含量降低，显示香附四物汤通过降低下丘脑的5-羟色胺的代谢率减轻原发性痛经的疼痛综合征。

4.2 在血液分析中的应用 由于微透析取样能收集不含蛋白质的样品，并能长期持续地从静脉中取样，所以倍受关注。汪晋［11］使用自制的微透析探针，结合液质联用分析技术，检测大鼠血液中游离态三七总皂苷的含量。方法学验证实验表明，该法为在体、实时及持续检测方法，可更为准确地检测体内游离态药物浓度。凌家俊等［12］采用微透析技术采血，应用高效液相色谱法分析青藤碱在大鼠血液中的浓度，得出青藤碱在大鼠体内的药动学过程符合静注二室模型，分布相和消除相的半衰期分别为10.98、44.71min，表明采用微透析技术检测青藤碱血液浓度方法有效可行。也有研究者利用微透析技术测定川芎嗪在大鼠脑纹状体及血液中的浓度。川芎嗪在两部位的AUC值说明，其具有较高的血脑屏障渗透性，与川芎嗪可改善中枢神经系统相吻合［13］。王小坡等［14］在鬼臼毒素血液微透析样品中加入依托泊苷(内标)，经乙酸乙酯液-液提取后，进行UFLC-MS/MS测定。经方法学验证，该法的日内、日间精密度及准确度均较小。结果表明，该法简单可行。

4.3 在皮肤和皮下组织分析中的应用 经皮微透析(Cutaneous microdialysis，CMD)技术的优点很多［15］，最大的优点是可真实反映局部皮肤药物浓度及代谢情况，并解决由于体外切除皮肤所遇到的水合、变性及细菌生长等问题。近年来，有关中药及其制剂的CMD研究越来越多。邓亚利等［16］采用微透析联用HPLC的方法，研究青藤碱雷公藤甲素巴布剂裸鼠的在体透皮吸收过程，方法学验证表明，该法能够在体、实时监测裸鼠皮下青藤碱和雷公藤甲素的动态浓度，为中药透皮吸收的研究提供新的方法。凌家俊等［17］利用微透析技术研究不同工艺制备的青藤碱贴剂的生物等效性，以裸鼠为实验动物，经皮给药，采用微透析法测定青藤碱的体内药量。结果表明，青藤碱的脂质体凝胶贴剂比普通凝胶贴剂具有更高的局部生物利用度，CMD技术可用于透皮贴剂的生物利用度及生物等效性研究。同年，该研究小组又以大鼠为研究对象，分别进行经皮及腹腔注射给药，采用微透析技术取样，高效液相色谱法分析，测定皮肤局部青藤碱浓度的动态变化。结果证实，微透析取样技术可以实现皮肤局部药物浓度的动态测定，与传统的皮肤药物浓度测定方法相比，具有明显优势［18］。王丹等［19］采用在体微透析取样技术联用RP-HPLC的方法，对大鼠皮肤中的葛根素进行了体内药代动力学考察。方法学考察证实，此法能够在体、实时监测大鼠皮下葛根素浓度，方法快速、准确、简便，为葛根素经皮给药体内药代动力学研究提供了理论基础。

4.4 在其他组织中分析的应用 Tsai等［20］利用微透析联合HPLC，同时测定了小檗碱在大鼠血液、肝脏、胆汁中的浓度。药时曲线表明，小檗碱iv给药后20min，在肝脏和胆汁达到峰浓度，在胆汁的浓度明显高于在血液和肝脏的浓度，提示小檗碱可能在胆汁中排泄。张英丰等［21］将微透析探针植入大鼠的右心室，实时、活体采集肌注盐酸青藤碱后的透析液样品，结果表明，盐酸青藤碱肌注后，血药浓度呈一级速率、一室模型，微透析法能较好地反映盐酸青藤碱肌注给药的药动学特征。

5 结语

目前，中药药效研究的核心是物质基础研究，而中药物质基础的体内分析是实现这一核心的重要手段。微透析取样技术具有高时间分辨性和选择性的优势，在中药药效研究中具有广阔的前景。然而，笔者认为，在中药的研究中普及微透析取样技术亟需解决2个问题:一是微透析在中药体内分析中的重现性较差，在检测浓度极低的同一种活性物质时，结果有时相差近10倍［22］，仍需寻找完善的回收率测定方法;二是目前微透析装置的核心部件(如微透析泵)均为国外进口，价格昂贵，对实验普及不利，国内自主微透析设备的开发势在必行。

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