自制AFP/CEA双标记TRFIA试剂临床应用效果观察

杨凤爱，吴修宇，利定建，姚锦绣，梁 健

(阳江市人民医院，广东阳江529500)

血清甲胎蛋白(AFP)与癌胚抗原(CEA)是肿瘤普查中两个最常用的指标，在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测及疗效评价等方面，有着重要的临床价值［1～3］。目前临床上采用的检测血清AFP和CEA的方法主要是化学发光法，所用试剂均为进口，价格昂贵。2010年 3～5月，我们采用稀土离子铕(Eu3+)和钐(Sm3+)为标记物，成功研制了AFP/ CEA双标记时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)试剂，现用其检测410份血清标本的AFP和CEA，并将其结果与化学发光法、进口试剂检测结果进行比较。现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 自制AFP/CEA双标记TRFIA试剂，以下简称AFP/CEA-TRFIA;AFP-CLIA试剂盒(SIEMENS公司);CEA-CLIA试剂盒(SIEMENS公司); AutoDELFIATMhAFP试剂盒(WALLAC公司);AutoDELFIATMhCEA试剂盒(WALLAC公司)。

1.1.2 质控品 国家AFP质控品(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ，期望浓度分别为25、65和150 U/mL);国家CEA质控品(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ，期望浓度分别为25、50和100 ng/mL)。

1.1.3 血清标本 由本院检验科提供，来自410例患者，共410份。

1.1.4 实验仪器 Auto-DELFIA 1235时间分辨荧光检测仪(Perkin Elmer公司)。

1.2 AFP、CEA检测方法 用AFP/CEA-TRFIA试剂和RRFIA法、化学发光法和AFP/CEA-CLIA试剂盒重复检测410份血清标本。每块反应板用对应的AFP及CEA国家质控品QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ进行质量控制(各设2复孔)。对两种方法检测结果有差异的血清再次用自制 AFP/CEA-TRFIA试剂、AFP/CEA-CLIA试剂和WALLAC公司的相应单标记试剂作复核试验(3复孔)。自制试剂检测采用一步法进行(具体操作参照自制试剂的研制时设计的操作步骤)，其他两种试剂均严格按其试剂盒内说明书进行。

1.3 结果判断方法

1.3.1 质控考核标准 ①各质控物的平均值在允许范围内;②重复样本的测定结果相差在10%以内。不能同时满足以上两个条件的反应板结果即视为无效，需重新进行测定。

1.3.2 参考范围 AFP-CLIA检测结果正常范围为0～8.1 ng/mL，CEA-CLIA为 0～5 ng/mL;Auto DELFIATMhAFP为0～8.7 U/mL(1 U/mL=1.21 ng/mL)，AutoDELFIATMhCEA为0～5 ng/mL。AFP/ CEA-TRFIA试剂参考范围 AFP为0～12 U/mL，CEA为0～6.5 ng/mL。超出正常范围为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。以化学发光法检测结果为金标准，计算灵敏度和特异度，同时绘制ROC曲线。

2 结果

2.1 可靠性考核结果 对所收集的410份血清标本用自制试剂进行测定，共用9块反应板，每块板均用AFP(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ)及CEA(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ)质控品进行质量控制(各设双复孔)结果显示各浓度质控物的测定平均值在允许范围内且重复样本的测定结果相差在10%以内，符合质控标准。

2.2 ROC曲线及曲线下面积 用自制试剂检测结果绘制ROC曲线，结果AFP、CEA两指标ROC曲线下面积(A z与B z)分别为0.978和0.976，说明本试剂的检测性能优秀。

2.3 灵敏度和特异度 以化学发光法检测结果为金标准，自制试剂检测AFP敏感性、特异性均为97.56%;检测 CEA敏感性 96.05%，特异性98.06%。

2.4 差异血清分析 410份血清中有10份血清AFP阴阳性检测结果两种方法不相同，其中假阳性3个，假阴性7个;有11份血清CEA阴阳性检测结果两种方法不相同，其中假阳性6个，假阴性5个。再次用自制试剂、化学发光试剂、AutoDELFIATMhAFP试剂盒和AutoDELFIATMhCEA试剂盒对这些差异血清进行重复和复核试验。结果10份AFP差异血清用自制试剂复查前后AFP检测结果完全相同，重复试验符合率达100%。有7份差异血清的AFP检测结果与AFP-CLIA、AutoDELFIATMhAFP试剂盒的测值相同;有2份差异血清(268、369号)与AutoDELFIATMhAFP试剂盒的测值相同，与 AFPCLIA试剂盒的测值不相同;有1份差异血清与AutoDELFIATMhAFP、AFP-CLIA试剂盒的测值不相同。11份CEA差异血清用自制试剂复查前后CEA检测结果完全相同，重复试验符合率达100%。有6份差异血清的测值与 CEA-CLIA、AutoDELFIATMhCEA试剂盒的测值相同;有2份差异血清与AutoDELFIATMhCEA试剂盒的测值相同，与CEA-CLIA试剂盒的测值不相同;有2份差异血清与 AutoDELFIATMhCEA、CEA-CLIA试剂盒测值不相同。

3 讨论

由于环境污染、食物因素、生活方式以及工作压力等因素的影响，目前世界上肿瘤的患患者数呈上升的态势。肝癌是我国比较多见的恶性肿瘤之一，其病死率在男性中居恶性肿瘤的第3位，在女性中居第4位，每年死于肝癌的人数大约在10万以上［4］。肝癌早期手术切除治疗效果较好，但晚期由于癌细胞扩散到全身，其手术切除治愈效果差。因此，早发现、早诊断、早治疗是改善肝癌预后的关键。血清学检测是肝癌早发现早诊断的重要手段之一，AFP是大家公认的诊断原发性肝癌的最为特异的指标。另外，在新生儿先天愚型和神经管畸形诊断方面，AFP也是一个公认的重要指标。CEA对由内胚层分化来的肿瘤，特别是消化道腺癌具有较高的阳性检出率，是结肠癌、胃癌等的重要检测指标。近年来大量的研究报道证实多种肿瘤标志物的联检对于肿瘤的诊断极为重要，其中AFP与CEA联合检测有助于判别原发性和继发性肝癌，而且对于良恶性肝病具有重要的诊断价值［5～7］。

目前对AFP和CEA两种指标检测的方法主要包括酶免法、放免法、化学发光法和TRFIA法。其中酶免法只能定性或半定量，放免法具有放射性污染，化学发光法一次检测只能测定一个指标，而TRFIA是超微量检测领域中一项新的检测技术，具有灵敏度高，标准曲线范围宽、标记物可稳定一年以上且无放射性污染、操作方便、能进行多标记等优点。本文研究的直接采用DTTA-Eu3+和 DTTA-Sm3+作为示踪物建立的AFP/CEA-TRFIA方法操作简单(一步法)、反应时间短(2 h)、线性范围宽、特异性和精密度好，且与进口Perkin Elmer公司同类单标记试剂在样本测定方面具有较好的相关性，一次检测能得到两种指标，符合人们向往已久的灵敏度高、无放射性污染、高效快捷等要求，因此在临床检测中具有极大的优势。

一种新的能够得到推广的试剂盒必须具备与之相匹配的灵敏度、重复性、准确性、精密性、特异性和可靠性，这是评价试剂盒好坏的金标准［8］。另外，通过对大量临床标本的检测，并将结果与同类产品或方法进行比较、统计和分析来综合考核与评价，也是考核体外诊断试剂临床实际性能的重要内容，是综合评价新研发产品敏感性和特异性的重要试验资料。本研究参考同类单标记试剂的实验研究方法［9，10］，用自制试剂对410份血清样本进行检测，并以化学发光法检测结果为金标准计算敏感性和特异度，结果其诊断AFP与CEA阳性的敏感性分别为97.56%和 96.05%，特异性分别为 97.56%和98.06%，总符合率分别为97.56%和97.32%。两种方法的测定值相关性良好。对差异血清的进一步检测，显示自制试剂的重复试验符合率达100%，表明自制试剂稳定性好。自制试剂操作简单(一步法)，费时短(2 h)，所需血清量少(25 μL)，在检测性能上与目前临床上广泛应用的化学发光法相仿，能满足临床应用的需要。另外，自制试剂一次检测可同时获得血清中AFP和CEA两种指标，这点对于一些珍贵的标本及在肿瘤的大规模普查上尤显优势，有推广应用的价值。

对于出现差异的原因，初步考虑为以下两个因素:①不同公司的试剂、不同检测方法所选用的抗原和缓冲体系可能不一样，导致所测结果有差异;②部分差异标本的测值在正常参考值范围的上限附近，这种称为灰区的测值有可能影响结果判断的准确性，需要进一步作临床追踪检测才可能进行试验结果的判断和临床意义的分析。

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［10］徐伟文，吴英松，杭建峰，等.时间分辨荧光免疫法定量检测AFP试剂盒临床应用研究［J］.标记免疫分析与临床，2006，13 (1):43-45.