基于地黄研发水产动物免疫增强剂:地黄的免疫调节研究进展

吴 春 聂国兴

(河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007)

顺应当今回归自然、追求绿色食品和健康消费的趋势，天然饲料添加剂已成为国内外的研究热点，我国传统的中草药免疫增强剂以其高效、安全以及成本低廉等优点而引起国内外科研工作者的注意。国内学者对中草药作为免疫增强剂的研究有了一定的认识，但其在畜牧、水产等不同的养殖领域发展并不平衡。

地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）是一种传统中药，在我国的河南、山东、山西、陕西等地都有大面积栽培，地黄属于玄参科植物，其药用部分为块根，具有调节机体免疫机能、抗肿瘤、影响机体内分泌和造血系统以及降血糖等多种药效。根据其块根炮制方法与药效的不同可分为鲜地黄、生地黄和熟地黄。地黄中化学成分主要有糖类、氨基酸、环烯醚萜苷等，它们是地黄药理作用的物质基础。糖类化合物主要包括多糖和寡糖，现已分离鉴定出8种糖：水苏糖、棉子糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露三糖、毛蕊花糖及半乳糖。生地黄中总多糖含量明显高于熟地黄和鲜地黄。地黄中含有丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸和精氨酸等20多种氨基酸，在加工熟地黄的过程中氨基酸含量，尤其是碱性氨基酸和游离氨基酸普遍下降。目前已从鲜地黄、干地黄、熟地黄中分离鉴定了几十种有效活性成分，除了地黄寡糖、多糖外，环烯醚萜及其苷类、地黄苷A、D等均显示出多种生理活性。但由于加工炮制方法的不同，其所含化学成分的种类和含量亦发生不同程度的改变，这些是地黄不同炮制品具有不同药理作用的主要原因。目前,地黄作为免疫增强剂的研究较少，基于地黄开发水产动物免疫增强剂具有广阔的前景。

1 地黄主要成分的免疫调节作用

免疫系统由具有免疫作用的分子、细胞及其相关组织和器官等构成。这些免疫系统发育是否正常，在很大程度上影响机体正常运转。地黄的主要成分（多糖、低聚糖、地黄苷）可通过不同的药理作用调节免疫系统，改善机体免疫力。

1.1 地黄多糖的免疫调节作用

地黄多糖可以改善机体的免疫机能，提高正常淋巴细胞转化率，促进小鼠免疫器官(肝、脾)的生长，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

胸腺和脾脏是机体内重要的免疫器官，胸腺皮质增厚、脾小结增大，表明机体免疫功能提高。地黄多糖对免疫器官的发育有较好的改善和刺激作用。苗明三等(2007、1999)报道，地黄多糖可增加血虚模型小鼠和代谢衰老模型小鼠的胸腺皮质厚度、脾小结大小和皮质细胞数，从而对模型小鼠胸腺及脾脏等免疫器官的萎缩产生拮抗。

单核-巨噬细胞是体内一种重要的非特异性免疫细胞，通过吞噬作用抑制和杀伤靶细胞，还可通过抗原呈递作用及分泌细胞因子调节T、B淋巴细胞及NK细胞的功能。赵素荣等(2006)采用灌胃和体外给药两种方法，探讨了地黄多糖对正常小鼠非特异性免疫和细胞免疫功能的影响，结果表明，在一定剂量范围内地黄多糖可显著提高小鼠的脾指数，增强单核巨噬细胞的吞噬功能，显著促进ConA刺激的T淋巴细胞增殖和小鼠外周血CD8+细胞比例。齐春会等(2001)发现，六味地黄多糖CA4-3对环磷酰胺造成的小鼠脾细胞抗体生成能力低下具有明显的改善作用，提高脾细胞产生IgG水平，进一步从CA4-3分离获得的地黄多糖CA4-3B和P-3对体外培养的正常和快速老化模型SAMP8和SAMR1小鼠B细胞亦有明显的促增殖作用。

地黄多糖可以通过上调血虚模型大鼠的某些细胞因子浓度而增强机体的体液和细胞免疫功能及造血机能。苗明三等(2002)研究发现，地黄多糖可促进免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，显著提高血虚模型大鼠血清的IL-2、IL-6和促红细胞生成素（EPO）水平。李发胜等(2008)研究表明，中剂量(100 mg/kg)熟地黄多糖通过促进IL-2的分泌增强正常小鼠的免疫机能。粒-巨噬细胞集落刺激因子能增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，有一定的免疫促进作用。熟地黄多糖可通过提高气血双虚模型小鼠血清粒-巨噬细胞集落刺激因子含量，促进骨髓造血和兴奋免疫。

地黄多糖b（单糖组成：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：阿拉伯糖=12：6：2：2：1）是兼具免疫与抑瘤双重作用的活性成分，增强机体的细胞免疫功能是其抑瘤的重要机制。陈力真等(1993)研究表明，地黄多糖b在体内外试验中均可明显提高正常小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖反应能力，促进白细胞介素2(IL-2)的分泌，从而改善荷瘤小鼠由于肿瘤生长引起的IL-2分泌功能的下降。地黄多糖b还可显著提高S180荷瘤小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活力，增强CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。

研究表明，多糖是调节机体免疫的物质基础，可明显促进和恢复机体免疫机能。现已发现多种中草药多糖可改善水产动物非特异性免疫功能，如茯苓多糖可提高中华鳖血清溶菌酶和补体活性；体外试验证实，黄芪多糖可作为免疫增强剂促进刺参体液吞噬细胞的吞噬活性和超氧离子的产生；饲料中添加黄芪多糖能提高黄颡鱼和罗非鱼非特异性免疫功能。由此可见，基于地黄多糖开发水产动物免疫增强剂，具备研发潜力。

1.2 地黄低聚糖的免疫调节作用

地黄低聚糖可促进免疫抑制小鼠B淋巴细胞恢复产生抗体的能力，增强免疫抑制小鼠和荷瘤小鼠脾细胞对绵羊红细胞(SRBC)的抗体反应，增强荷瘤小鼠的脾淋巴细胞增殖反应和小鼠的细胞免疫功能。

低聚糖能够提高机体的免疫机能，主要通过充当免疫佐剂以及激活机体体液和细胞免疫等途径得以实现。水产动物试验表明，低聚异麦芽糖和低聚果糖可提高罗非鱼血清中溶菌酶和补体的活性；低聚果糖还能提高幼鳖SOD酶活力、增重率和成活率；饲料中添加低聚木糖可不同程度地提高草鱼和凡纳滨对虾的非特异性免疫功能。

1.3 地黄苷A的免疫调节作用

地黄苷A为地黄的有效药用成分，可增强机体体液免疫和细胞免疫功能。王军等(2003)试验表明，地黄苷A可以显著增加免疫功能低下小鼠体重，降低血浆cAMP含量和cAMP/cGMP值，提高小鼠血清溶血素水平，增强小鼠迟发性变态反应。地黄苷A还可促进骨髓造血及外周血白细胞增殖，对抗环磷酰胺致小鼠白细胞减少症，升高白细胞减少症模型小鼠的白细胞、血小板及红细胞数，增加小鼠体重及骨髓有核细胞数量和骨髓DNA含量。

2 配伍方式与剂型影响地黄的免疫调节作用

2.1 地黄单剂的免疫调节作用

地黄中除了主要成分对免疫系统起调控作用，各种水提液和煎剂也能够增强机体细胞免疫功能以及平衡机体免疫因子的分泌。

在脾脏淋巴细胞中，碱性磷酸酶被认为是B淋巴细胞增殖和分化的分子标志物。鲜地黄汁、鲜地黄水煎液和干地黄水煎液均能明显提高甲状腺素诱导的类阴虚小鼠脾脏淋巴细胞碱性磷酸酶的表达活性，表明地黄能提高阴虚小鼠的脾脏B淋巴细胞功能。地黄水煎液还可明显促进小鼠B淋巴细胞的增殖和分化，并提高免疫力低下小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

肿瘤坏死因子（TNF）是一种重要的免疫调节因子，熟地黄水提液能够刺激小鼠单核细胞分泌TNF-α，从而产生较强的抗肿瘤效应。过敏性皮炎(AD)是一种炎症性皮肤病，患者Th2细胞对过敏原的反应及白细胞浸润增强，血清IgE水平升高。病变部位炎性细胞因子IL-4和TNF-α的mRNA表达水平升高，Th2细胞趋化因子TARC、MDC、RANTES和细胞黏附分子表达增强。地黄水提取物（RGE）可抑制NC/Nga小鼠炎症部位细胞因子、趋化因子和黏附分子的过表达，减少Th2细胞和嗜酸性粒细胞的浸润，调节过敏原引起的免疫功能失调，阻止过敏性皮炎的发生。

2.2 地黄合剂的免疫调节作用

2.2.1 六味地黄丸的免疫调节作用

六味地黄丸由熟地黄、山茱萸、淮山药、泽泻、牡丹皮、茯苓等6味中药以8：4：4：3：3：3的质量比水煎浓缩而成，方剂以熟地黄为主药，辅以山萸肉、山药。研究发现，六味地黄丸主要通过增强机体T淋巴细胞、红细胞以及吞噬细胞等免疫细胞的功能来增强机体免疫力。

复发性口疮（RAU）是一种原因不明的口腔黏膜常见病，属于自身免疫性疾病，发病期细胞免疫功能处于抑制状态，T淋巴细胞亚群的平衡失调。六味地黄丸对RAU患者外周血T淋巴细胞亚群有显著的调节作用，可显著提高CD3和CD4，有效地纠正CD4+/CD8+的比例失调，稳定机体的细胞免疫功能。

红细胞免疫功能是机体免疫功能的重要组成部分，红细胞免疫功能低下与多种疾病的发生和病理过程密切相关。曹建恒等(2005)研究表明，六味地黄丸可改善红细胞免疫黏附调节因子的功能，显著升高RBC-C3bRR和RBC-ICR，降低循环免疫复合物（CIC）水平，提高红细胞的免疫功能。

多形核白细胞(PMNLS)是乳牛体内主要的吞噬细胞，是机体防御感染的第一道防线。在适当浓度范围内，六味地黄丸对多形核白细胞的免疫功能起明显的调节作用，六味地黄丸可促进外周血及乳中多形核白细胞的杀菌能力，显著提高血液和乳中吞噬细胞超氧基的释放水平。六味地黄丸还可显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞表面Ia抗原表达的阳性率，从而增强巨噬细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、吞噬指数以及吞噬活性。

此外，六味地黄丸还可以作用于免疫器官提高机体免疫力。如高剂量六味地黄丸加减复方可提高免疫功能低下小鼠体重以及胸腺和脾脏重量，显著增加耳廓肿胀度，增强机体的免疫功能。六味地黄丸还可以激活造血干细胞，通过影响骨髓中造血干细胞的数量和增殖能力，提高造血机能，进而有助于提高老年小鼠的免疫功能。

2.2.2 六味地黄汤的免疫调节作用

六味地黄汤（LW）由熟地黄、山茱萸、淮山药、泽泻、茯苓、牡丹皮6味中药组成。药理学研究表明，LW能够明显改善多种免疫功能低下及自身免疫性疾病模型动物的免疫功能。

LW可增强环磷酰胺所致免疫抑制小鼠以及糖皮质激素肾阴虚小鼠的细胞及体液免疫，可以使小鼠体重明显增加，提高模型小鼠外周血CD3+和CD4+细胞百分率，促进血清IgM、IgG和IgA的生成，增强T细胞的增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能。LW还能够明显提高快速老化小鼠（SAMP8）脾脏CD4+T细胞百分率和CD4/CD8的比值，提示LW对SAMP8 T、B细胞功能及T细胞亚群的平衡具有调节作用。通过促进CD8分子表达，恢复CD4+/CD8+平衡，LW可起到抗肿瘤作用。

LW对免疫功能的调节具有双向性，对正常小鼠，LW可增强Notch信号强度，促进胸腺淋巴细胞向T抑制性细胞分化；对免疫老化的SAMP8，LW能够降低Notch信号强度，抑制胸腺淋巴细胞向T抑制性细胞的过早分化。

2.2.3 其他地黄合剂的免疫调节作用

地黄与其它中草药配制成的地黄合剂，对免疫系统疾病或免疫功能紊乱性疾病均具有良好的疗效。

与四君子汤（人参、甘草、茯苓、白术）合用后可上调原发性肝癌介入术后患者CD4+T淋巴细胞、NK细胞比例，提高IFN-γ的产生，对患者细胞免疫功能有上调作用。

多发性硬化（MS）是中枢神经系统原发性脱髓鞘性疾病，患者免疫功能异常，表现为T辅助细胞增多，T抑制性细胞水平下降。采用地黄合剂（熟地黄、山萸肉、麦冬、肉苁蓉、白芍、肉桂、胆南星、地龙、郁金）治疗后，患者外周血（PB）及脑脊液（CSF）中 CD8+细胞数升高，CSF中CD4+细胞以及CSF和PB中CD4+/CD8+比值降低，EDSS评分降低，复发次数减少。说明地黄合剂能有效地调节MS免疫功能的紊乱，对中枢神经系统的异常免疫应答有疗效。

免疫性血小板减少性紫癜（ITP）是自身免疫性疾病，系存在抗血小板抗体和免疫介导所致的血小板减少，其发生与机体免疫内环境失衡有关。程纬民等(2006)研究表明，地黄止血方（水牛角、白茅根、生地黄、赤芍、丹皮、生黄芪）对 ITP患者 CD3+、CD4+水平有明显提高作用,并显著降低CD8+水平，改善CD4+/CD8+比值，明显改善ITP患者的T细胞免疫功能和机体免疫内环境失衡。

此外，地黄合剂还能明显改善多种免疫性疾病模型动物的免疫功能。地黄合剂（由生地黄、功劳叶、生黄芪、制香附）能拮抗环磷酰胺对小鼠的免疫抑制作用，通过提高辅助性T细胞（Th细胞），纠正T细胞亚群分布的紊乱状态和提高脾细胞产生IL-2这两条途径实现免疫调节作用。参芪地黄丸可对抗D-半乳糖所致的小鼠亚急性衰老过程，明显升高衰老小鼠脾脏指数及淋巴细胞转化率，提高血清IL-2水平，降低血清IL-6水平，一定程度上延缓免疫衰老。

3 基于地黄研发水产动物免疫增强剂的前景

中草药作为免疫增强剂在人体健康、畜禽养殖等领域得到了广泛重视，但在水产养殖方面还缺乏系统的研究。当前，消费者十分关心水产品安全，因中草药无毒、无害、无残留、无耐药性的优势，利用其研发水产动物免疫增强剂，部分或全部替代抗生素等药物，提高水产品安全和品质，日益受到业界重视。试验表明，黄芪、旱莲草、当归、茯苓、鱼腥草、板蓝根和金银花等中草药单剂或合剂配合饲料应用于水产养殖业，可显著增强水产动物机体非特异性免疫力。

黄芪、旱莲草水提液单剂可显著增强罗非鱼溶菌酶活性和吞噬细胞的吞噬功能。茯苓、鱼腥草和板蓝根均可使鲤鱼的红细胞C3b受体花环率升高。黄芪和当归以5：1配合，可明显增强大黄鱼和建鲤血液中NBT阳性细胞活性，提高血清中补体活性以及增重率和存活率。黄芪和金银花合用可显著增强罗非鱼血液中吞噬细胞的呼吸爆发活动，降低试验鱼的死亡率，提高机体免疫力。

地黄是传统中药，河南省地黄资源丰富。研究证实，其免疫调节作用十分显著，因此，基于地黄研发水产动物免疫增强剂，前景广阔。