辣椒游离小孢子培养研究进展

成 妍，马蓉丽，焦彦生，吴海涛，巫东堂

（山西省农业科学院蔬菜研究所，山西太原 030032）

辣椒（Capsicum annuumL.）原产于中南美洲，明末传入我国并被广泛种植，是人们广为熟知的一种蔬菜和调味品，它包括有辣味的辣椒（chili pepper）和无辣味的甜椒（sweet pepper）[1]。由于辣椒是常异花授粉植物，杂种优势十分明显，因此，其单倍体遗传育种研究具有非常重要的意义。

自1973年王玉英等[2]以跃县小辣椒为试材进行花药培养获得植株以来，国内外众多学者在辣椒花药培养研究方面进行了大量研究[3-4]，使花药培养成为目前获取辣椒单倍体较成熟的技术，已被应用于辣椒的遗传育种工作中[5-7]。游离小孢子培养与花药培养相比，不仅单倍体再生率高，而且避免了愈伤组织和体细胞胚的产生。同时，小孢子的单倍性和单细胞特性为遗传转化提供了好机会[8-10]。目前，有关辣椒游离小孢子培养的成功报道较少，还没有达到建立起完善、高频的小孢子培养再生体系的程度，不能应用于遗传育种或基础性研究，因此，非常有必要对辣椒游离小孢子培养技术及其影响因素进行深入细致的摸索研究。

1 供试材料对胚胎发生的影响

1.1 基因型

胚状体的诱导与供体基因型密切相关。不同基因型植株在同样的试验条件下，游离小孢子培养的诱导频率差异很大[11]。基因型对小孢子胚胎发生能力的决定作用主要体现在2个方面：一是基因型的反应范围，二是胚胎发生频率的差异[12]。Supena等[13]采用相同的培养条件对印度尼西亚辣椒的10个基因型进行培养，结果表明，不同基因型间胚产量差异显著，胚产量最高的可达31.5胚/蕾；同时发现，光皮类型的培养效果优于皱皮类型。李春玲等[14]对灯笼椒、牛角椒、羊角椒、线形椒和朝天椒分别进行游离小孢子培养，发现除朝天椒05-1007仅获得小孢子愈伤组织外，其余品种均得到了小孢子愈伤组织和胚状体。王烨等[15]研究了5个辣椒品种小孢子离体培养前期的存活率，认为基因型不同导致对不同预处理的反应不同。

1.2 供体植株的生理状况

不同栽培环境、不同花期、不同部位的花蕾，其花粉的生理状况不同，会导致小孢子胚诱导率的差异[16]。Kim等[17]在人工气候室采用25℃/20℃的昼夜温度和16 h/8 h的光周期，小孢子培养的出胚率较高。在无人工气候室的情况下，可利用温室和田间具备供体植株适宜生长温度的季节，即每年春秋季开展工作。在夏季温度较高时，采用降温措施使温室中温度低于30℃，在秋季光照不足时进行人工补光，以维持植株正常生长。不同花期和不同部位的花蕾由于营养状况不同，其中适于培养的小孢子所占的比率不同，导致产胚率的差异。进行人工整枝、连续摘除将要开放的花蕾及幼果，可使幼小的适宜取材花蕾发育良好[18]。

1.3 小孢子发育时期

小孢子发育时期通常分为单核期、双核期和三核期，而并非任何时期的小孢子都适于培养。单核期又分为单核早期、单核中期和单核靠边期[19]。通常最适宜游离小孢子培养的时期为单核靠边期。张祖姣等[20]研究了兴蔬301不同大小花蕾的细胞学和形态学关系，发现辣椒小孢子发育不同时期花蕾和花药的大小差异显著或极显著，依据花器官形态特征可判断小孢子的发育时期。张菊平等[21]也认为，辣椒小孢子发育时期与花蕾的外部形态特征、花药颜色密切相关。张芳等[22]对6个不同果形和果味辣椒材料的3个相同取蕾时期的花药进行染色观察，比较发现，不同基因型辣椒的相同花器官外部形态所对应的小孢子发育时期存在一定的差异，但各品种与单核晚期相应的花器官外部形态特征存在共性，即花蕾的花瓣长于萼片0.12 mm，花药尖部略微紫色（到背面1/3处紫色）时，各个材料的小孢子大部分均处于单核期。

2 培养技术对胚胎发生的影响

2.1 分离小孢子的方法

目前，主要是通过自然释放和机械挤压这2种方法得到游离小孢子。Supena等[13]采用液固双层培养基进行小孢子看护培养，2～3周后花药正常开裂，将小孢子释放到培养基中。自然释放法的优点是不会对小孢子造成损伤，但培养效果不佳，研究者多采用机械挤压方法[3]。刘凡等[9]、李春玲等[14]首先对花药进行15 d的预培养，然后采用直接挤压法得到游离小孢子。Kim等[17]用微型搅拌器高速研磨花药10 s得到游离小孢子。另外，利用Percoll密度梯度离心来分离膨大的小孢子，可以达到纯化的效果。

2.2 小孢子接种密度

接种密度大小对小孢子培养具有十分重要的作用，它影响胚诱导和小孢子发育进程。Kim等[17]在4×104～16×104个/mL之间设置了6个不同的小孢子接种密度，发现每皿产胚量与小孢子接种密度成正比。但密度太大、太小都会影响子叶形胚的产量。采取4×104个/mL的接种密度在培养3周时未见胚状体产生，随着培养时间的延长，只能产生极少量的子叶形胚。采取16×104个/mL的接种密度在培养3周时就能产生大量球形胚，但这些球形胚从此停止发育。最优的接种密度是10×104个/mL。

2.3 基本培养基

辣椒游离小孢子培养的基本培养基主要有CP，NLN，MS等。Mityko等[23]比较了 3 种基本培养基（NLN，R92，CP）的诱导效果，发现小孢子在NLN培养基中培养时可获得最多数量的多细胞团。刘凡等[9]和李春玲等[14]分别采用CP基本培养基进行辣椒游离小孢子培养，取得了理想的结果。Supena等[13]比较了在MS培养基上进行小孢子看护培养和在AT3培养基上进行游离小孢子培养的效果，认为前者更适合于辣椒小孢子培养。Kim等[17]在小孢子预处理时对比了无碳源培养基和B5培养基，结果显示，前者对于胚的诱导更有效。

2.4 碳源

一定浓度的糖类物质的添加既可作为碳源，又具有维持培养基渗透压的作用，常用的糖类物质有蔗糖、麦芽糖。Supena等[13]进行小孢子看护培养时使用浓度为2%的麦芽糖。Kim等[17]分别比较了6%，9%和12%的3种蔗糖与麦芽糖对小孢子胚诱导能力的影响，结果表明，采用添加蔗糖的培养基所获得的胚状体不仅在数量上而且在质量上均优于麦芽糖，且9%的蔗糖诱导效果最好。王烨等[15]研究表明，无碳源的花药预培养对提高小孢子存活率作用明显。

2.5 活性炭

在培养基中添加活性炭可吸附培养过程中小孢子释放的毒性代谢物质，如ABA和酚类化合物等，从而促进小孢子胚的发生、发育。陈晓等[11]在辣椒花培试验中发现，添加活性炭能提高胚状体的诱导率，0.25%～0.5%范围内的活性炭得到的诱胚率差异不明显。Supena等[13]在对印度尼西亚辣椒的小孢子看护培养中，研究了不同活性炭浓度对小孢子培养的影响，表明活性炭对小孢子胚的形成是必需的，且活性炭的最适浓度为1%，低浓度的活性炭可增加小孢子胚总产量和子叶形胚产量，但高浓度的活性炭会影响小孢子胚的成苗。

2.6 温度胁迫

温度胁迫是影响小孢子胚状体发生的最主要因素。一般来说，从植株上采下花蕾后，直接进行小孢子培养，很难诱导胚状体发生。温度胁迫可改变小孢子发育途径，从而阻止小孢子向成熟花粉粒方向发展，沿着胚胎的发展途径，最后形成胚[9]。刘广霞等[24]认为，4℃低温预处理花蕾能大大提高胚状体诱导率。王烨等[15]研究表明，4℃的花药预培养对提高小孢子存活率作用明显，并且对5个供试品种都有作用。Supena等[13]认为，辣椒小孢子看护培养首先在4℃下处理花蕾1 d，然后9℃处理接种于固液双层培养基中的花药1周，可获得最佳效果。李春玲等[14]采用35℃的高温胁迫成功完成了胚胎发生和成苗。刘凡等[9]认为，游离小孢子细胞团培养中以35，32℃预处理下的出胚率较好，7℃处理下获得的胚状体很少，而在温度处理的不同天数间差异不明显。Kim等[17]在（31±1）℃下热激 3 d，取得了较好的培养效果。

2.7 激素

植物激素是调节细胞分裂和伸长的一类活性物质。培养基中激素种类和浓度，常对调控细胞的分裂、生长和分化起着极为重要的作用[14]。Supena等[13]研究发现，在小孢子看护培养的上层液体培养基中添加2.5 μmol/L玉米素和5 μmol/L IAA能显著提高小孢子胚总产量和子叶形胚产量。刘广霞等[24]认为，MS培养基中添加0.1 mg/L的2，4-D或KT可以提高花培效果，较高质量浓度的NAA（1.0 mg/L）的胚状体诱导率达到最高。然而，刘凡等[9]研究初步表明，液体培养基中高水平的激素对促进胚状体细胞的分裂和分化没有积极作用。同样，Kim等[17]和李春玲等[14]都采用不含激素的培养基获得了较高的胚诱导率。

3 雄核发育和胚胎发生

接种后能够膨大的小孢子会继续发育，皱缩的小孢子则死亡。李春玲等[14]研究表明，不同类型辣椒游离小孢子的雄核发育与胚胎发生程序相同。小孢子最初的细胞分裂有均等和不均等这2种方式。脱分化的小孢子可经历胚胎发生和器官发生2种发育途径，二者之间也可相互转换。小孢子在分裂早期如果突破花粉壁会形成薄壁细胞团，继续发育为愈伤组织，进而转向器官发生途径。小孢子愈伤组织易形成不定根，也可形成次生胚状体，但未观察到不定芽的发生。辣椒游离小孢子胚胎发生过程与合子胚发育过程相似，3周可见球形胚与心形胚，4周出现子叶形胚[17]。胚状体发育具有高度不同步性，其中，只有20%的是正常完整的子叶形胚（由胚根、胚轴和子叶3部分组成）[13]。

4 小孢子胚的植株再生

成熟的胚状体转移至再生培养基上，给予适宜的温度和光照条件，1～2 d可转绿，5 d内生根，1～2周便可萌发为完整植株[17]。胚状体胚芽、子叶端发育及萌发能力明显低于胚根端[14]。在所有的胚状体中仅有5%能成苗，而具有2片子叶的胚状体成苗率可达100%。正常小植株极易移栽成活[13]。

5 小孢子植株的倍性鉴定及其加倍处理

小孢子植株倍性鉴定的方法主要有染色体计数法、流式细胞测定法、形态学鉴定法、细胞学特征鉴定法等[25]。刘凡等[9]取继代培养中生长良好的小孢子苗的叶片，采用流式细胞仪进行染色体倍性分析，结果表明，获得的再生株中具有单倍体、双单倍体以及单倍-双倍嵌合体植株。由于胚状体发育早期镜检显示，分裂细胞团来自小孢子，因此，后二者应该是小孢子细胞团分裂分化过程中，染色体自然加倍形成的双单倍体材料，以及可能在同一细胞团中，部分细胞染色体发生了加倍，而部分细胞没有染色体加倍产生的混倍体材料。单倍体人工加倍的方法以化学诱变法最常用，常用的诱变剂有秋水仙碱、氟乐灵、对二氯苯、8-羟基喹啉等，其中，以秋水仙碱加倍效果最好。用秋水仙碱溶液处理根、芽等分生组织，或直接加在培养基中，都可以起到一定的加倍作用。

6 存在问题与展望

目前，辣椒游离小孢子培养技术在实践中还存在很多问题，如：材料不易消毒灭菌，污染严重；花药壁厚，脆性大，不易获得干净高活力的小孢子；小孢子游离后活力容易丧失；在所有诱导产生的小孢子胚中，发育完整的子叶形胚数量少；非子叶形胚成苗难；单倍体小孢子植株人工加倍率低等[19]。这些问题困扰着无数研究者，亟待解决。辣椒已有通过花药培养而成的品种在生产中推广应用，但小孢子培养育成的辣椒品种还没有报道。现今大部分研究成果仍只停留在实验室阶段，不能投入到实际生产中去。

在今后的研究中应加强理论和实验技术方面的工作。不仅要研究辣椒小孢子胚胎发生和小孢子胚植株再生的影响因素，以及小孢子再生植株倍性鉴定和染色体加倍技术，改进培养方法、培养基配方及培养条件，建立能稳定、高效地获得纯合二倍体的辣椒游离小孢子培养体系，而且要深入探讨小孢子发育的调控机理，为该技术发展提供理论依据。相信在不久的将来，通过国内外研究者进一步深入系统研究，辣椒游离小孢子培养必然会有广阔的发展前景。

［1］Kothari S L，Joshi A，Kachhwaha S，et al.Chilli peppers-a review on tissue culture and transgenesis[J].Biotechnol Adv，2010，28：35-48.

［2］王玉英，郭敬三，三敬驹.小黑麦和辣椒花粉植株的诱导[J].中国科学，1973（1）：104-105.

［3］ Lantos C，Gemes A J，Somogyi G，et al.Improvement of isolated microspore culture of pepper （CapsicumannuumL.）via co-culture with ovary tissues of pepper or wheat[J].Plant Cell Tissue Organ Cult，2009，97：285-293.

［4］ Santana-Buzzy N，Canto-Flick A，Iglesias-Andreu L G，et al.Improvement ofin vitroculturingofHabaneropepper byinhibition ofethylene effects[J].Hort Science，2006，41：405-409.

［5］陈肖师.甜椒花药培养及“塞花一号”的育成[J].中国蔬菜，1988（3）：5-7.

［6］李春玲，蒋仲仁.甜椒花培新品种“海花三号”的育成[J].园艺学报，1990，17（1）：39-44.

［7］邢永萍，张树根，张军民，等.保护地甜椒新品种海丰26号选育初报[J].辣椒杂志，2003（3）：22-23.

［8］Bal U，Abak K.Haploidy in tomato（Lycopersicon esculentumMill.）：a critical review[J].Euphytica，2007，158：1-9.

［9］刘凡，赵泓，陈斌，等.辣椒游离小孢子细胞团培养的胚状体形成 [J].分子细胞生物学报，2007，40（6）：371-379.

［10］陈斌，耿三省，张晓芬，等.辣椒单倍体培养研究进展[J].长江蔬菜，2007（12）：36-41.

［11］陈晓，詹玉丝，徐小利，等.花药培养建立辣椒DH纯系的初步研究[J].河南农业科学，2003（9）：52-55.

［12］苏维，常彩涛.辣椒单倍体培养研究进展 [J].天津农业科学，2010，16（4）：11-14.

［13］ Supena E D J，Suharsono S，Jacobsen E，et al.Successful development of a shed-microspore culture protocol for doubled haploid production in Indonesian hot pepper（Capsicum annuumL.）[J].Plant Cell Rep，2006，25：1-10.

［14］李春玲，佟曦然，朱至清，等.辣（甜）椒游离小孢子培养中的雄核发育和胚胎发生 [J].园艺学报，2008，35（11）：1613-1620.

［15］王烨，张宝玺，连勇，等.不同预处理对辣椒小孢子存活率的影响[J].中国蔬菜，2004（4）：4-6.

［16］Ercan N，Sensoy F A，Sensoy A S.Influence of growing season and donor plant age on anther culture response of some pepper cultivars （Capsicum annuumL.）[J].Sci Hortic，2006，110：16-20.

［17］Kim M，Jang I C，Kim J A，et al.Embryogenesis and plant regeneration of hot pepper（Capsicum annuumL.）through isolated microspore culture [J].Plant Cell Rep，2008，27：425-434.

［18］ Koleva-Gudeva L，Trajkova F，Dimeska G，et al.Androgenesis efficiency in anther culture of pepper（Capsicum annuumL.）[J].Acta Hortic，2009，830：183-190.

［19］Koleva-Gudeva L，Spasenoski M，Trajkova F.Somatic embryogenesis in pepper anther culture：the effect of incubation treatments and different media[J].Sci Hortic，2007，111：114-119.

［20］张祖姣，杨博智，周书栋，等.辣椒小孢子发育的细胞学观察[J].辣椒杂志，2009（1）：38-41.

［21］张菊平，巩振辉，刘珂珂，等.辣椒小孢子发育时期与花器形态的相关性 [J].西北农林科技大学学报，2007，35（3）：153-158.

［22］张芳，李海涛，张馨宇.不同基因型辣椒相同花器外部形态小孢子发育时期的差异[J].中国蔬菜，2009（10）：23-27.

［23］MitykoJ，Fari M.Problems and results of doubled haploid plant production in pepper（Capsicum annuumL.）via anther and microspore culture[J].Acta Hortic，1997，447：281-287.

［24］刘广霞，张晓伟，蒋武生，等.温度及培养基中添加物对辣椒花药培养胚状体诱导的影响 [J].河南农业科学，2009（5）：97-100.

［25］陈斌，赵泓，耿三省，等.辣椒花药培养再生株群体染色体倍性构成的多样性[J].华北农学报，2007，22（1）：123-128.