凋亡抑制基因survivin与卵巢癌的研究新进展

沈媛媛 武 璁 陶 可

北京大学深圳医院妇产科，广东 深圳 518036

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来其发病率一直呈不断上升趋势，且也是妇科死亡率最高的恶性肿瘤。据1995年的美国癌症统计资料显示，卵巢癌已成为妇女第5位常见的恶性肿瘤和第4位癌症死亡原因[1]。而美国癌症研究所（NCI）预测，2008年美国卵巢新发病例将达21650例，死亡15520例[2]。虽然卵巢癌早期确诊患者的5年生存率可达80%-90%，但近70%的患者确诊时已至晚期，且FIGO Ⅳ期侵袭性卵巢上皮癌患者5年生存率不足20%[3]。即使晚期患者经过系统治疗达完全缓解，仍有60%-70%会出现复发，而耐药又是治疗失败的主要原因[4]。研究证实多种化疗药物通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗癌作用，因而寻求一种能促使卵巢癌细胞凋亡或增加其对化疗药物敏感性的辅助治疗手段，对提高患者的生存率直至彻底治愈有着重要意义。Survivin是近年发现的一种细胞凋亡抑制基因，具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重功能，它与卵巢癌细胞的生长、侵袭转移及耐药密切相关[5]。如何靶向survivin治疗卵巢癌成为研究的热点。现就近几年survivin在卵巢癌中的研究新进展作一综述。

1 Survivin结构、分布与功能

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins,IAP）家族中的新成员，由Ambrosini等[6]于1997年应用效应细胞蛋白酶受体-1（effector cell proteinase receptor-1, EPR-1）的cDNA 通过杂交方法在人类基因组文库中筛选并鉴定出来，是目前发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin蛋白能够调节所有细胞分裂和存活。

1.1 Survivin结构与分子生物学功能特征

在人类和小鼠，survivin基因定位于17q25染色体，全长14.7kb，包含4个相对分子质量16.5kd。Survivin基因启动子近端均含有细胞周期依赖元件（CDE）和细胞周期同源区域（CHR）。人的survivin基因有三个CDE，分别位于-6、-2、-171位点，一个CHR位于-42位点。由survivin 基因编码的产物称为生存蛋白或存活素，是一个包含143个氨基酸残基相对分子质量为16389的蛋白质[7]。

与IAP 家族其他成员不同的是，survivin蛋白具有以下特点：①N端只有一个较为保守的杆状病毒属抗细胞凋亡重复序列（baculovirus IAP repeat, BIR）结构域，该结构域是对凋亡程序执行元件caspase-9、caspase-3或caspase-6与caspase-7发挥抑制作用的主要基团；②BIR分子被Cys46-Pro47-Thr483个氨基酸构成的插入序列分成两半；③C端缺乏锌指结构，而含有1个由42个氨基酸构成的α-螺旋结构，其晶体结构呈广泛二聚体化排列，体外实验显示这种结构特征可显著增强其凋亡抑制功能[8]。

目前，学者已发现7个不同抗凋亡特性的survivin剪接异变体[9,10]：①survivin-ΔEx3缺乏外显子3，保留了抗凋亡活性；②survivin-2B是将内含子作为隐形外显子，几乎无抑制细胞凋亡的活性；③survivin-3B与凋亡抑制有关；④survivin-2α能削弱survivin的抗凋亡活性，增加肿瘤细胞对化疗的敏感性；⑤另3个异构体survivin-140、survivin-121、survivin-40在人和鼠组织内均有发现，且只表达于胚胎组织，前两者有抑制凋亡作用。

1.2 Survivin的组织分布 在胚胎及胎儿期survivin表达非常丰富。而在成人正常细胞中，除了胎盘和胸腺微弱表达外，其它组织基本很难检测到survivin的表达[6]。但在人类大多数恶性肿瘤组织中，survivin mRNA和蛋白呈广泛高表达。Tamm等[11]采用NCI 抗肿瘤药物筛选程序中的60种人类肿瘤细胞株，研究了survivin在体外培养细胞株的表达。结果显示，60种肿瘤细胞株均有survivin表达，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤等。Liguang等[12]对114例卵巢组织标本进行研究后发现，73%的卵巢癌、47%的交界性卵巢癌和19%的卵巢良性肿瘤survivin表达阳性，而所有正常卵巢标本中均未见survivin的表达；且survivin的表达率与卵巢癌的临床分期、分化分级和淋巴结转移呈正相关，但与腹水和组织学类型无相关性。同样地，Kleinberg等[13]对卵巢癌肿瘤积液、相对应的原发肿瘤及实体转移瘤中的survivin表达情况进行免疫组化分析发现，实体转移肿瘤中的细胞质survivin异常高表达（99%），明显高于相对应的肿瘤积液（88%）和原发肿瘤（92%）；核survivin高表达在肿瘤积液、原发肿瘤和实体转移瘤中分别为72%、90%和93%。随后，Wang等[14]用SABC免疫组化法检测55例原发性卵巢黏液性肿瘤中的survivin表达，结果发现survivin在良性、交界性和恶性组的阳性表达率分别为2/20、12/15和20/20，呈升高趋势，其中良性与交界性、良性与恶性组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。良性、交界性和恶性组survivin的胞核阳性表达率分别为1/20、6/15和5/20，其中良性与交界性组比较差异有统计学意义(P<0.05)。这意味着suvivin的表达可能出现于肿瘤恶性转化的早期，在肿瘤的恶性转化过程中发挥抑制细胞凋亡，促进分裂、增殖的作用，且随着卵巢黏液性肿瘤的恶性进展，凋亡抑制蛋白survivin表达上调。

1.3 Survivin与细胞周期调控 正常的细胞周期分为分裂间期（G1、S、G2期）和分裂期（M期）。Survivin基因通过影响细胞周期对细胞的增殖分化起着重要作用。首先，Survivin基因的表达具有细胞周期依赖性，其启动子近端CDE和CHR的存在是细胞周期中G2/M期基因表达的特征，CDE片段缺失，则survivin基因的周期依赖性表达特征也随之丧失。在有丝分裂开始时，survivin与纺锤体的微管蛋白特异性结合，此时若抑制survivin的表达，则会干扰survivin与微管蛋白的结合，细胞有丝分裂不能正常进行[6]。紧接着，有研究[15]证实，Survivin RNA在G1期的表达基本检测不到，在S期表达增加6倍，而在G2/M期表达则增加了40倍。Suzuki等[16]的实验结果也证实，过表达survivin 会加速细胞向S期转换，导致细胞对G1期阻滞的抵抗，促进Cdk2/ cyclinE复合体的激活，进而导致Rb蛋白磷酸化，促进细胞的周期进程及细胞有丝分裂，提示肿瘤组织中过度表达survivin的细胞可能以此实现逃避细胞凋亡检查点的检查，使有丝分裂异常，细胞异常增殖，并处于不稳定的转化状态。这些研究表明，survivin的过度表达可通过克服G2/M期的调控点促进细胞的旺盛增殖和恶性转化。

1.4 Survivin与细胞凋亡 细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是由凋亡基因严密调控的机体为了调整器官发育、免疫细胞分选、应对细胞损伤、更好的适应生存环境而主动争取的死亡过程。体内存在两条凋亡信号转导途径，即外源性Fas-FasL介导的膜受体途径和内源性线粒体途径。凋亡基因的表达非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如cmyc、抑癌基因p53等[17,18]。

转基因技术证实，survivin与Caspase特异性结合，抑制Caspase-3、Caspase-7的活性，从而阻断各种刺激（如Fas、Caspase、Bax和某些化疗药物）诱导的细胞凋亡过程。Survivin也可通过p21间接抑制Caspase，survivin与细胞周期调控因子CDK4结合形成survivin-CDK4复合体，使p21从CDK4复合体中释放出来，p21进而与线粒体Cspase-3结合，抑制其活性，阻断细胞的凋亡过程。而如果在有丝分裂开始时干扰survivin与微管蛋白的结合，则survivin抗凋亡活性丧失，Caspase-3的活性增强，导致细胞凋亡[15,19]。

1.5 Survivin与血管形成 有研究提示，没有血管的肿瘤生长有限，并长期处于休眠期。血管新生为卵巢癌细胞的生长、增殖提供必需的营养物质和生长因子，因而在卵巢癌发生、进展与转移过程中发挥重要作用。血管生成方式中微血管内皮细胞源于宿主成熟的血管内皮细胞，在促血管生成因子作用下，原始的间充质细胞发生分裂增殖分化，并最终形成新生血管。最重要的促血管新生的细胞因子有：血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、血管生成素（angiopoietin, Ang）等。Survivin具有调控血管生成的潜在作用，通过保护促进肿瘤血管内皮细胞的生长增殖而为癌细胞的生长转移创造条件，进而影响肿瘤细胞的生物学特性和行为以及临床治疗耐受[20]。Blanc-Brude等[21]报道，股动脉损伤小鼠平滑肌细胞survivin的功能丧失后可阻止血管新生内膜的形成。Fu等[22]通过siRNA survivin特异性抑制VEGF表达减少肿瘤血管生成，可达到siRNA survivin干扰中流间质和抑制肿瘤细胞的双重作用。此外，有研究还发现，Ang22的作用依赖于survivin的表达上调，其通过survivin抑制Caspase-3来调节肿瘤血管生成[23]。

1.6 Survivin与卵巢癌化疗敏感性 大量研究[24,25]证实，多种化疗药物通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗癌作用，而肿瘤细胞的化疗敏感性是决定抑瘤效果的关键因素。Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制基因，其表达与卵巢癌的组织学分级相关、侵袭性间呈正相关，且其异常高表达使卵巢肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性增加，并介导卵巢癌多药耐药的形成[26]。

为了探讨对铂耐药和铂敏感卵巢上皮性卵巢癌患者ERCC1（excision repair cross complementation group 1）蛋白、survivin蛋白的表达及其与临床病理特征及化疗敏感性之间的关系，Xie等[27]采用免疫组化法检测64例上皮性卵巢癌组织中ERCC1和survivin的表达情况。结果发现铂敏感与铂耐药患者之间、ERCC1阳性表达与阴性表达患者之间以及survivin阳性表达与阴性表达患者之间在发病年龄、FIGO分期、病理类型、组织学分级、有无淋巴结和/或脉管转移等方面的组间差异均无统计学意义（P>0. 05）。铂耐药患者ERCC1 阳性表达率（67.85%, 19/ 28）高于铂敏感患者（25.00%,9/36）。铂耐药患者survivin阳性表达率（78.57%, 22/28）与铂敏感患者（75.00%,27/36）差异无统计学意义。ERCC1表达与survivin表达间无相关关系（rs=0.12,P=0. 36）。ERCC1与survivin共表达的患者中发生铂耐药的比例（65.22%,15/23）与ERCC1单表达患者中发生铂耐药患者的比例（80.00%,4/5）间差异无统计学意义。认为测定上皮性卵巢癌组织中ERCC1的表达对预测铂耐药的发生有较大价值survivin蛋白对预测铂耐药暂无肯定价值。

Zaffaroni等[28]研究发现，稳定转染表达survivin的cDNA可增加卵巢癌细胞对紫杉烷类药物的抗药性，使癌细胞失去对治疗的敏感性，细胞质survivin高表达的卵巢癌显示出对紫杉烷类/铂类药物疗法的临床耐受和较低的临床及病理完全缓解率，提示survivin可作为一个指示卵巢癌化疗耐药性的生物学指标。

2 靶向survivin治疗卵巢癌的可行性与安全性评估

卵巢癌是导致妇科恶性肿瘤患者死亡最高的一种恶性肿瘤，因缺乏特异性的早期症状和筛检指标，大多数EOC患者在疾病确诊时往往已处于晚期阶段，现有的根治手术、放化疗并没有带来令人满意的疗效。因而迫切需要最佳的生物学标志物来预测卵巢癌根治术病人的术后反应，为制定进一步治疗方案的提供可靠依据。鉴于survivin在卵巢癌细胞周期调控、凋亡与血管形成中的发挥重要作用，越来越多的学者将目光投向靶向survivin表达治疗卵巢癌的研究中。目前，抑制基因表达常采用RNA干扰、反义技术以及转入没有功能的突变体与该基因竞争技术等。

2.1 RNA干扰技术 RNA干扰（RNAi）是一项能有效而特异地抑制基因表达的新技术，通过将双链RNA 导入细胞，裂解为21-23个碱基长度的双链小干扰RNA（short interfering RNA, siRNA）或设计针对性的短发卡RNA（short hairpin RNA, shRNA），特异性降解相应序列的mRNA，导致相应的基因转录后沉默。

Yan等[29]设计特异性的survivin shRNA，探讨其对人卵巢癌耐药细胞OVCAR3 survivin 基因表达、凋亡及其对泰素敏感性的影响。检测结果显示靶向survivin的序列特异性shRNA可有效抑制OVCAR3细胞中的survivin基因的表达，同时可增强OVCAR3对泰素的敏感性。随后Huang等[30]应用RNA干扰技术抑制survivin和程序性细胞死亡的基因6（PDCD6）表达的，可逆转FSH对细胞凋亡和增殖影响。Tarapore等[31]的研究结果也证实，以包装RNA（packaging RNA,pRNA）作为小干扰RNA（siRNA）是一种有效的沉默卵巢癌survivin表达的方法。最新的一项研究表明，使用shRNA技术靶向卵巢癌细胞系SKOV3的survivin能够有效抑制癌细胞增殖、迁移。推测shRNA技术可能有望成为卵巢癌治疗的新突破[32]。

因而，靶向耐药基因的RNA 干扰技术与化疗药物联合有望成为治疗卵巢癌新的突破口，它为克服卵巢癌化疗耐药提供新途径，为新型抗癌药物开发提供新思路。

2.2 Survivin反义寡核苷酸技术 反义寡核苷酸技术是利用合成的寡核苷酸与靶RNA结合来抑制靶基因的表达的技术。Ambrosini等[33]用EPR-1基因作为survivin反义寡核苷酸，用其cDNA序列转染卵巢癌HeLa细胞，在稳定转化的细胞中抑制了内源性survivin的表达，从而实现了对癌细胞的凋亡诱导和增殖抑制。Ruan等[34]研究survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞COC1/DDP生长、凋亡及细胞周期的影响，结果发现survivin反义寡核苷酸能抑制COC1/DDP细胞的生长，降低survivin mRNA的表达，并诱导癌细胞凋亡。考虑到紫杉类耐药的比紫杉类敏感的卵巢癌细胞表达更高的survivin，Vivas-Mejia等[35]用反义方法沉默紫杉类耐药的卵巢癌细胞survivin 2B，结果发现癌细胞对紫杉类化疗药敏感性明显提高，认为卵巢癌细胞对紫杉类耐药可能与survivin 2B直接相关。

2.3 针对survivin上、下游调控因子的方法 基因表达受上、下游启动子、增强子、沉默子、转录因子等调控影响。Tu等[36]使用凋亡抑制基因survivin和卵巢特定的启动子OSP-2进行基因治疗，结果发现OSP-2能具体促进卵巢癌细胞survivin表达而抑制细胞凋亡。Felisiak-Golabek等[37]发现，survivin转录抑制因子TP53蛋白能有效抑制紫杉类耐药的卵巢癌细胞核中survivin的表达。

2.4 基因联合治疗 McKay等[38]提出了卵巢癌的基因联合治疗策略，构建了腺病毒载体共转survivin显性负突变体（Ad-Survivin-T34A, 34位Thr被Ala替代而不能被Cdc2磷酸化，进而使survivin失活）和Procaspase-3于卵巢癌细胞之中,发现由外源性地增加Procaspase-3（可诱导细胞凋亡）所诱导的内源性survivin表达升高得以消除，提示共转的survivin显性负突变体在诱导细胞凋亡的同时，还能与Procaspase-3产生协同作用，提高Procaspase-3的单独治疗效果。

2.5 激素治疗研究 促黄体激素（luteinizing hormone, LH）和卵泡刺激素（follicle stimulating hormone, FSH）在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。研究[30,39]证实，LH和FSH在卵巢癌发生和进展过程中起着重要作用，二者均能够增加卵巢恶性肿瘤的风险，抑制卵巢癌细胞凋亡。

Huang等[30]的研究结果表明，FSH通过survivin的表达而增加VEGF的表达，进而促进卵巢肿瘤组织的血管化，为其生长、转移提供必须条件。随后，他们又发现FSH促进卵巢癌细胞增殖和阻止其凋亡是通过SAPK/JNK和PI3K/Akt信号转导途径激活survivin实现的。同时，FSH还能下调诱导细胞凋亡所需的两个必要分子：程序性细胞死亡的基因6（PDCD6）和死亡受体5（DR5）的表达。在体外，Zhang等[39]向卵巢癌细胞培养体系中加入LH和顺铂，用免疫印迹检测survivin的表达，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果发现LH通过抑制细胞凋亡和上调survivin的表达来影响卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。

2.6 药物研究方面 耐药是目前卵巢癌治疗急需解决的难题。最近研究显示，卵巢癌组织及细胞中均有survivin的高表达，可能与其抑癌耐药有关。因而，使用针对阻抑survivin表达的药物，可能会对卵巢癌起到良好的疗效。白藜芦醇是从植物白藜芦根提取的药物成分，具有心脏保护作用，在心内科已广泛应用。近来的研究发现，白藜芦醇具有抗癌特性。Aggarwal等[40]通过上调p21Cip1/WAF1、p53和Bax以及下调survivin、BCL-2、Bcl-xL、细胞周期蛋白D1和E的表达，并且激活caspases蛋白而发挥肿瘤抑制作用。托芬那酸（tolfenamic acid, TA）是一种抗炎镇痛药。最近的一项研究[41]提示，TA通过抑制的survivin表达发挥抑制对小鼠体内OC生长、减少OC细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用。因而，可能成为下一个有效的OC化疗药物。

综合以上研究，通过各种分子生物学技术、激素以及某些药物来阻断survivin表达，进而拮抗其抑制细胞凋亡的能力、降低细胞凋亡的阈值、恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是可行的。然而，卵巢癌是恶性度很高的肿瘤，往往需要大剂量、长疗程、高效化疗放、化疗，而基因治疗尚处于起步阶段。例如，使用survivin干扰裸鼠HepG2肝细胞，有可能诱发某些原癌基因的激活与淋巴瘤、肺癌等多种肿瘤[42]。因此，在靶向survivin治疗卵巢癌之前，需对各项治疗方法安全性进行深入细致的研究与评估。

3 Survivin与卵巢癌的预后相关性

卵巢上皮癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤。目前，临床应用的肿瘤细胞减灭术联合化疗后，患者的5年生存率仍徘徊在30%-40%。众多研究[43]证实，在恶性肿瘤中survivin表达越高，提示预后越差。

为了探索survivin在评估卵巢癌预后的重要作用，Athanassiadou等[44]选取100例卵巢癌标本涂片进行免疫细胞化学染色检测survivin的表达情况，结果发现肿瘤恶性程度和细胞组织学分级越高，则survivin的表达越高（P<0.0001），且病人的存活率降低（P<0.00001）。

肿瘤中survivin的异常表达与肿瘤的化疗耐药和复发率密切相关，高表达survivin的肿瘤显示出对化疗的抵抗、复发可能性增加以及生存率降低[45]。Kleinberg等[46]提出以细胞核survivin的表达情况作为化疗前预示患者治疗效果的指标，高水平的细胞核survivin表达预示较好的治疗效果和较高的生存率。随后Qian等[47]对10例卵巢囊腺瘤、17例交界性肿瘤、64例上皮性卵巢癌用多克隆抗survivin抗体进行免疫组化染色，显示85.94%（55/64）的卵巢上皮性卵巢癌病例抗survivin抗体免疫组化染色阳性，23.53%（4/17）的卵巢交界性肿瘤染色阳性，10例卵巢囊腺瘤染色结果均为阴性；且上皮性卵巢癌患者细胞核survivin阳性百分率与临床分期，病理分级，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）标记指数强相关（P<0.01）。认为核survivin表达是判断卵巢上皮性卵巢癌预后的一个有效、独立的指标。No等[48]的研究结果也表明，血清survivin水平可较好地反映浆液性卵巢癌腹膜转移情况，可作为判断卵巢癌预后的有用标志物。

与以上研究结果不同的是，为了研究survivin表达与妇科肿瘤科预后的相关性，Ferrandina等[49]对110名卵巢癌患者进行了研究。免疫组化的结果发现，84.5%的患者癌细胞浆呈survivin阳性表达，29.1%的细胞核阳性；卵巢癌恶性度越高，细胞核阳性率越低。凋亡相关其他因素Bcl-2和p53的表达分别见于27.3%和60.0%的病例，两者表达均与survivin的表达无关。且无论是细胞浆还是细胞核中survivin表达均与卵巢癌预后无相关性。

4 展望

卵巢癌发病率高而存活率低，对女性的健康造成极大的威胁。尽管目前采用手术、化疗、放疗等治疗手段使卵巢癌的存活率有了很大提高，但晚期患者即使经过系统治疗达完全缓解，仍有60%-70%会出现复发。而耐药又是治疗失败的主要原因。Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制基因，其高表达使肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性增加，并介导肿瘤多药耐药的形成。鉴于survivin在卵巢癌细胞周期调控、凋亡与血管形成中的发挥着重要作用，探索各种新的分子生物学技术和基因治疗方法，阻断survivin表达而拮抗其抑制细胞凋亡的能力，降低细胞凋亡的阈值，恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，进而使卵巢癌获得根治成为可能，从而避免卵巢癌细胞耐药和转移扩散给病人带来的痛苦，具有深刻的指导意义。

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