ICU病区泛耐药的鲍曼不动杆菌碳青霉烯类药物耐药基因分析

陈士华 魏取好 吕火烊

泛耐药(pandrug－resistant，PDR)是指分离菌株对临床常用的绝大多数抗菌药物均耐药的菌株。鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，AB)特别是泛耐药的鲍曼不动杆菌(pandrug－resistant Acinetobacter baumannii，PDR－AB)是院内定植及导致难治性医院感染的主要病原体［1，2］。随着广谱或超广谱抗菌药物的广泛及不协规范的使用，导致PDR－AB发生率增高，PDR－AB的耐药机制复杂，且多种耐药机制共存，常见的包括β－内酰胺酶特别是碳青霉烯酶的产生、药物作用靶位的改变、外膜通透性下降及药物主动外排等等。近年来，研究表明PDR－AB对碳青霉烯类抗菌药物的耐药主要其产生多动碳青霉烯类酶，如blaVIM、blaNDM－1和blaIMP和OXA酶，而其中最为多见的为OXA酶。OXA酶可分为4个族，第1族是blaOXA－23，第2族是blaOXA－24，第3族是blaOXA－51和第4族blaOXA－58，其中第1族和第4族是由质粒介导，而中间2和3族是由染色体介导［3］。本研究对近2年分离自笔者医院的20株PDR－AB进行了耐药性及耐药基因的检测，现报道如下。

材料与方法

1.菌株来源:2009年1月～2010年12月从笔者医院ICU病区分离的泛耐药的鲍曼不动杆菌(pandrug－resistant Acinetobacter baumannii，PDR－AB)20株，所有菌株均由Vitek－32全自动微生物鉴定系统鉴定及药物敏感性试验筛查。质控菌株大肠杆菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心。

2.仪器与试剂:全自动微生物鉴定系统Vitek－32及配套试剂革兰阴性杆菌鉴定卡(GNI+);哌拉西林(piperacillin，PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，TZP)、头孢噻肟(cefotaxime，CTX)、头孢他啶(ceftazidime，CAZ)，头孢曲松(ceftriaxone，CRO)，头孢吡肟(cefepime，FEP)，头孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，CPS)，亚胺培南(imipenam，IMP)，美罗培南(meropenem，MEM)，庆大霉素(gentamycin，GEN)，阿米卡星(amikacin，AMK)，环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)，米诺环素(minocycline，MIN)，复方新诺明(trimethoprim－sulfamethoxazole，SXT)和多黏菌素B(polymyxin B，POB)E－试条均购自法国梅里埃公司;PE－9700 PCR仪(美国ABI公司);Eppendorf 5417R高速离心机(德国艾本得); Bio－Rad GelDoc凝胶电泳成像分析系统 (美国伯乐公司); MH琼脂干粉购自英国OXIOD公司;PCR通用试剂盒EmeraldAmpTMPCR Master Mix及DNA分子质量标准 DL2000TMDNA Marker均为宝生物工程(大连)有限公司新产品，各种耐药基因引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其序列见表1。

表1 PCR扩增基因种类引物序列及产物大小(bp)

3.菌株鉴定及抗菌药物的耐药性试验:按全自动微生物鉴定系统Vitek－32及配套试剂革兰阴性杆菌鉴定卡(GNI +)使用说明书对菌株进行鉴定;哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)，头孢曲松(CRO)，头孢吡肟(FEP)，头孢哌酮/舒巴坦(CPS)，亚胺培南(IMP)，美罗培南(MEM)，庆大霉素(GEN)，阿米卡星(AMK)，环丙沙星(CIP)，米诺环素(MIN)，复方新诺明(SXT)和多黏菌素B(POB)的耐药性检测用浓度梯度法(E－试条法)，其耐药性解释标准(除CPS)参照CLSI2011中关于不动杆菌属的规定［4］;CPS的解释标准参照辉瑞公司建议的标准(MIC值:≤16 S，32 I，≥64 R)。

4.耐药基因检测:模板DNA的提取各种靶基因PCR扩增检测参加文献进行略作修改［5］。具体为:每反应体系P1引物1μl(1.0μmol/L)、P2引物 1μl(1.0μmol/L)，dNTPs 2μl (2mmol/L)，10倍缓冲液2μl［KCl 10mmol/L，(NH4)2SO48mmol/L，MgCl22mmol/L，Tris－HCl(pH9.0)10mmol/L，NP400.5%，BSA 0.02%(wt/vol)］，Taq DNA pol1U(不计体积)，超纯水9μl，模板液5μl，总反应体积20μl。PCR扩增热循环参数均为:94℃预变性2min，然后94℃ 60s→50℃ 60s→72℃ 60s，循环35周期，最后1个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。

结果

1.抗菌药物浓度梯度法检测结果:20株PDRAB对PIP、TZP、CTX、CAZ、CRO、FEP、CPS、IMP、MEM、GEN、CIP的耐药率均为100%;AMK的耐药率55%，MIN的耐药率70%，SXT的耐药率80%，POB的耐药率为0%;各菌株的详细结果见表2。

2.耐药基因PCR扩增结果:20株PDR－AB株，检测blaOXA－23、blaOXA－24、blaOXA－51、blaOXA－58、blaVIM、blaNDM－1和blaIMP 7种耐药基因，检测blaOXA－23、blaVIM和blaIMP基因阳性9株，阳性率45%;blaOXA－23阳性，6株，占阳性菌株中的66.7%(6/9)，分别为1号、5号、6号、9号、12号和17号菌株;blaVIM阳性2株，占阳性菌株中的22.2%(2/9)，分别为2号和15号菌株;blaIMP阳性1株，为19号菌株。20株 PDR－AB PCR扩增blaOXA－23基因电泳结果见图1。

表2 20株PDR－AB对15种抗菌药物耐药性的体外检测结果

图1 PCR扩增blaOXA－23基因结果

讨论

ICU病区由于病人基础疾病较重，抗菌药物使用较广，多耐药菌株的分离率相对较高。PDR－AB是这些菌株中的典型代表菌，为条件致病菌，近年来已成为医院感染的主要病原菌之一，引起的感染逐年增加［6～8］。笔者医院ICU分离到的20株PDR－AB对临床常用的14种抗菌药物中的11种全部耐药，只对阿米卡星(AMK)、米诺环素(MIN)，复方新诺明(SXT)3种部分菌株敏感;而对临床不常用的多黏菌素B，所有菌株均敏感(表2)。对由PDR－AB感染的病人，临床可综合考虑选用阿米卡星(AMK)、米诺环素(MIN)，复方新诺明(SXT)及多黏菌素B进行治疗。

研究表明，PDR－AB对碳青霉烯类药物的耐药机制由以下几个因素引起，一是产生各种碳青霉烯类酶(包括金属β－内酰胺酶)，二是青霉素结合蛋白(PBPs)的改变，三是通透性的改变(如膜孔蛋白OprD的缺失)，四是主动外泵的增加等，而其中最为主要的因素是产生各种碳青霉烯类酶［9～11］。本研究对20株PDR－AB主要检测了blaOXA－23、blaOXA－24、blaOXA－51、blaOXA－58、blaVIM、blaNDM－1和blaIMP 7种碳青霉烯类药物的耐药基因。检测到blaOXA－23、blaVIM和blaIMP基因阳性9株，阳性率45%;其中blaOXA－23阳性，6株，占阳性菌株中的66.7%(6/9);blaVIM阳性2株，占阳性菌株中的22.2%(2/9);blaIMP阳性1株，占阳性菌株中的11.1%(1/9)(图1)。说明笔者医院ICU病区的PDR－AB可能存在有3种以上的碳青霉烯酶基因，而在这些基因中又以blaOXA－23为主。OXA类酶为Bush分类中的D类(2d)β－内酰胺类酶，结构上与C类青霉素结合蛋白相关，具有活性丝氨酸位点，能水解碳青霉烯类菌物，不能被克拉维酸抑制。编码OXA类酶的基因blaOXA可以在染色体上，质粒上，转座子上。目前已发现140多种OXA类酶。OXA型酶耐药谱一般较窄，但近年来可水解第3代头孢菌素和(或)亚胺培南的超广谱OXA酶不断被发现，主要由OXA－2或OXA－10突变衍生而来，其编码基因通常位于质粒或整合子上，具有很强的扩散能力。对鲍曼不动杆菌的研究主要集中在4族突变(blaOXA－23、blaOXA－24、blaOXA－51、blaOXA－58)体上，blaOXA－23为其中的一族(包括blaOXA－23、blaOXA27和blaOXA－49)，由质粒介导［3］，易引起传播，故临床对分离到此PDR－AB的病人应尽快做好隔离。

本研究检测到另外2型碳青霉烯酶基因blaVIM和blaIMP，均为金属β－内酰胺酶(metallo－betalactamase，MBL)基因，能水解除单环类抗菌药外包括碳青霉烯类在内的几乎全部的β－内酰胺类抗生素，基因可位于染色体或质粒高度可移动遗传因子上，并可被整合子捕获，这使得MBLs基因具有可传播性，MBLs不能被β－内酰胺酶抑制剂所抑制，成为治疗的一大难题［12，13］。

综合本研究结果，笔者医院ICU病区分离的PDR－AB对临床绝大多数抗菌药物耐药，选用抗菌药物应依据实验室的检测结果。对碳青霉烯类药物的耐药机制检测表明，笔者医院ICU病区的PDRAB以产blaOXA－23型碳青霉烯类酶为主，其次为blaVIM和blaIMP金属β－内酰胺酶(MBL)，由于这些基因均可在质粒上且可被整合子捕获，因此很容易在菌株或菌属之间传播，因此临床加强对此类菌的监测及预防隔离工作。

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