HCV 实验动物模型研究进展

陶万银，张 岩，钟 劲

HCV 属于黄病毒科，是一种有包膜的正链RNA病毒。HCV 感染人肝细胞，导致慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。目前尚无疫苗可供预防。治疗慢性丙型肝炎（丙肝）的标准方案为长效干扰素联合利巴韦林，疗效还有待提高。

HCV 的实验动物模型不仅是HCV 免疫学、病理学和病毒学等基础科学的重要研究手段，还为HCV 疫苗和创新药物的研发提供了关键的工具和平台。HCV 有着高度的宿主特异性，人类是目前发现的HCV 的唯一宿主。HCV 不能感染有着完善的遗传学操作工具的模式实验动物，如小鼠、大鼠等。通过实验接种，黑猩猩可以被HCV 感染，而且疾病的发生和发展与人类感染HCV 有着一定的相似性，因此长期以来黑猩猩一直是HCV 研究的唯一动物模型。但是黑猩猩作为濒临灭绝的灵长类动物，其在科研中的使用在动物伦理学上有着很大的争议。加之黑猩猩的实验使用成本非常昂贵，世界上仅有少数实验室能最终使用黑猩猩，因此开发经济实用的HCV 小动物模型十分迫切。最近几年，利用树鼩和人源化小鼠建立HCV 的小动物模型有了良好的进展。本文介绍常用的几种HCV 实验动物模型的发展和应用。

1 HCV 感染的黑猩猩模型

黑猩猩基因组约98%与人类相同，是目前已知的除人类外唯一可以被HCV 感染的灵长类动物，在HCV 研究发展进程中起到了不可替代的作用。20 世纪70年代中后期，临床上发现了一种不同于当时已知的甲型肝炎和乙型肝炎的新型肝炎，称为非甲非乙型肝炎。用此类患者血制品感染黑猩猩，也能发展成肝炎，最终确定这种肝炎是一种新病毒导致的。第一个HCV 序列正是从感染的黑猩猩血浆中提取的核酸中鉴定出来的[1]。第一个具有感染性的HCV cDNA 克隆也是在黑猩猩中验证的，将体外转录制备的HCV RNA 注射到黑猩猩肝脏中，最终使黑猩猩感染了病毒[2-3]。

黑猩猩作为HCV 研究的动物模型有着如下优势：①研究HCV 的急性感染。HCV 患者在感染的急性期症状大多很轻微，等确诊时往往已经发展为慢性感染，因此很难在人群中进行HCV 急性期感染的研究。而黑猩猩作为实验动物，可以用来研究在急性期内HCV 的病毒学变化和宿主的免疫反应。②黑猩猩在HCV 感染进程、病理学和免疫反应方面与人类比较类似，是研究HCV 自然感染的理想对象[4]。③由于拥有与人类高度相似的免疫系统，黑猩猩可用于HCV 疫苗的研发。

2 HCV 感染的树鼩模型

树鼩是我国西南地区及东南亚地区常见的一种小动物，体型比大鼠略小，曾被归为食虫目或灵长目，后被划分为独立的树鼩目。树鼩在进化上较小鼠更接近人类，可用于多种人类疾病模型的研究，如HBV 感染[5]。HCV 感染树鼩也有报道[6-7]，在Xie等[6]报道中，接种丙肝患者血浆后20%～35%的树鼩血浆中HCV RNA 含量可达约104IU/ml。最近Amako等[8]报道了令人欣喜的进展，使用基因1b 型患者的血浆或者细胞培养获得的病毒，在树鼩中建立了HCV的持续性感染，并观察到肝纤维化和肝癌等病变。在为期3年的感染实验中，血浆中的HCV RNA 在一些时间点可以被检测到；测定扩增出的HCV 非结构蛋白（non-structural protein,NS）5A 区域序列后发现了变异；树鼩阳性血浆再感染新的树鼩时同样可以建立感染，确定了接种病毒在树鼩体内的持续复制。3年后感染树鼩的肝脏中依然可以检测到低水平的HCV RNA，并且发生了组织纤维化和癌变。这是首次报道HCV 感染树鼩引起的肝纤维化和肝癌。

目前树鼩在HCV 研究中的应用还没有得到推广，主要有2 个原因：①树鼩在饲养繁殖环节、遗传背景品系和遗传工程操作上还达不到一个模型动物的要求；②HCV 感染树鼩的现象还须要更多独立实验室的重复。根据现有的报道来看，HCV 感染树鼩的阳性率仍然不高，而且HCV RNA 在树鼩血浆中的水平通常比在患者血浆中低2～3 个数量级，说明树鼩不是HCV 感染的最佳宿主。Tong 等[9]报道了在缺少某一种受体的细胞中过度表达人或者树鼩的HCV 受体分子可以同样有效地支持HCV 假病毒的侵入，表明树鼩受体分子同样可以有效地支持HCV 侵入宿主细胞。如果侵入树鼩肝细胞不受阻碍，那么有可能是树鼩肝细胞缺少了某种人类特异的可支持HCV 复制的宿主因子，或者树鼩细胞的免疫反应限制了HCV 的复制。如何克服这些种属间的差异，建立高效的树鼩感染模型是最终决定树鼩能否成为研究HCV 的实验动物模型的关键。

3 用于HCV 研究的小鼠模型

小鼠是目前使用最广泛的实验动物之一，实验成本低，遗传背景清楚，研究手段丰富，然而自然状态下小鼠并不能被HCV 感染。在过去的十年里，研究人员通过各种手段改造小鼠，使小鼠成功感染HCV。目前有3 种用于HCV 研究的小鼠模型：①表达HCV编码蛋白的转基因小鼠；②含有来源于人体组织或细胞的嵌合型小鼠（或称人源化小鼠）；③表达人源HCV 宿主因子的转基因小鼠。以下分别介绍这3种模型的特点。

3.1 表达HCV 编码蛋白的转基因小鼠模型 早期的HCV 小鼠模型通常是用转基因方法，将HCV 全长基因组或者表达特定蛋白的基因组片段整合到小鼠基因组中，构建持续性表达HCV 蛋白的转基因小鼠。Moriya 等[10]在2 种不同品系的小鼠中用HBV的启动子控制表达HCV 的核心蛋白，出生16 个月后约1/3 的转基因小鼠发生了肝癌。这表明HCV核心蛋白具有诱导肝细胞癌变的能力。这种模型的局限性是转基因小鼠中的HCV 蛋白通常会过度表达，而且HCV 基因片段是随机整合到小鼠基因组中的，有可能造成额外的影响。另外，此种小鼠模型缺乏HCV 侵入细胞和在细胞中复制的过程，因此其应用非常有限。

3.2 含有来源于人体组织或细胞的嵌合型小鼠模型 Mercer 等[11]最早报道了一种含有人肝细胞的嵌合型小鼠可以被HCV 感染。在严重联合免疫缺陷型（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠中，引入白蛋白启动子控制尿激酶型纤溶酶原激活基因（urokinase-type plasminogen-activator gene,uPA）的表达，其肝脏特异表达的uPA 将造成持续性的小鼠肝损伤，这时候将人的肝细胞移植到小鼠中，即可建立人肝嵌合型小鼠模型。用丙肝患者血清感染这种嵌合型小鼠，约75%的小鼠感染后血浆中可检测到HCV RNA 水平为3×（104～106）copies/ml，并持续存在15～35 周。这是HCV 小鼠模型的一次重要突破。该模型已被用于HCV 病毒进化[12]和抗病毒药物开发[13]等多方面的研究。

通常在uPA-SCID 嵌合型小鼠中人肝细胞比例仅为15%[14]。由于uPA 造成的肝损伤，uPA-SCID小鼠很难饲养，而且移植手术必须在小鼠出生后2 周内完成。最近报道了更加高效的嵌合模型Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-（FRG 小鼠）[15-16]。延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydroxylase,FAH）是酪氨酸代谢途径最后一个酶，FAH 缺失造成有毒代谢产物的积累，从而引起小鼠肝损伤。使用2-（2-nitro-4-trifluoromethylbenzyol）-cyclohexane-1,3-dione（NTBC）处理可以阻断有毒代谢产物积累，维持小鼠肝细胞正常功能[17]。FRG 小鼠正常饲养时加入NTBC，须要移植外源细胞时停止给药即可，因此更易于饲养和移植，而且嵌合肝脏中人肝细胞所占比例最高可达到95%[18]。使用HCV 感染者血浆或细胞培养的病毒均可以感染FRG 小鼠，HCV RNA 最高可以达到107copies/ml[18]。但FRG 小鼠依然是免疫缺陷的，不能用于研究宿主对HCV 感染的免疫反应、HCV 发病机制和疫苗的研发等工作。此外，人肝细胞供体来源于人成体肝组织，存在个体间差异，来源也受到一定的限制。这些都是该模型更广泛应用所须要克服的障碍。近年来干细胞技术发展很快，已有报道将人的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS）分化成具有功能的肝细胞[19-20]，而且体外实验证明这种来源的肝细胞可以被HCV 感染[21-22]。如果iPS 来源的肝细胞最终能代替成体肝组织成为FRG 小鼠的供体，将会极大地促进该模型的实际应用。

最近Washburn 等[23]报道了同时具备人肝细胞和免疫细胞的HCV 小鼠模型。在免疫缺陷型的Balb/C Rag2-/-Il2rg-/-小鼠中，白蛋白启动子控制FK506结合蛋白与caspase 8 融合蛋白特异性在小鼠肝细胞中表达，造成可诱导性肝细胞损伤，诱导后可接受人源肝细胞移植。在该小鼠中同时移植来源于胎肝组织的人肝母细胞和人造血干细胞，可以发育出成熟的人肝细胞和淋巴细胞。在感染HCV 的人源化小鼠肝脏中可检测到HCV RNA，同时还能检测到HCV 特异性T 细胞应答反应、肝星状细胞的活化和肝纤维化相关基因的表达。最终约50%的人源化小鼠中出现肝纤维化症状，这也是首次报道HCV在小鼠感染模型中可以导致肝细胞纤维化。这一模型在研究HCV 感染的免疫应答反应和发病机制方面将有广泛的用途。遗憾的是，该模型小鼠的血浆中检测不到HCV RNA，这或许是由于人的肝母细胞在小鼠中发育出的肝细胞功能不完全，还不能高效支持HCV 的复制。进一步优化这种同时具备人肝细胞和免疫细胞的小鼠模型将是本领域发展的重点之一。

3.3 表达人源HCV 宿主因子的转基因小鼠模型 构建HCV 小鼠模型的另外一种尝试是通过基因改造，将HCV 感染所必需的人源宿主因子转到小鼠基因组中，使其可以支持HCV 感染。HCV 侵入细胞的受体分子CD81、SR-B1、Cluandin-1 和Occludin[24-27]已经陆续被鉴定出来，HCV 假病毒和细胞培养来源的真病毒可以侵入同时表达这4 种人源受体分子的小鼠细胞[26]。但是Hikosaka 等[28]发现同时含有这4 种人源受体分子的转基因小鼠却依然不能被HCV 感染。这或许是由于小鼠肝细胞不能有效支持HCV 复制，导致常规手段检测不到HCV 的感染。Rice 研究组报道了更加灵敏的小鼠模型[29]。他们用腺病毒载体，将人的CD81、SR-B1、Cluaudin-1 和Occludin 基因同时转入荧光素工具小鼠的肝细胞中表达。荧光素工具小鼠的启动子和编码区之间存在终止序列，该序列两端含有loxp 位点，当有Cre重组酶存在时，可识别并剪接掉loxp 之间的终止序列，从而激活荧光素基因的表达。同时，他们在HCV基因组上加入Cre 基因（HCV-Cre），然后感染上述小鼠。HCV 是正链RNA 病毒，其基因组本身可作为mRNA 直接翻译蛋白，因此HCV-Cre 进入细胞后不须要复制即可表达Cre 蛋白。实验结果表明，与未转入受体分子的对照组小鼠相比，HCV-Cre 病毒感染后可以检测到肝细胞中荧光酶活性显著提高。研究者还利用该模型验证了HCV 特异性中和抗体在体内感染的保护效果，发现用包膜蛋白疫苗免疫后的小鼠与对照组相比，感染HCV-Cre 病毒后荧光素酶活性显著下降，显示了疫苗的保护作用。这一小鼠感染模型使用了免疫系统正常的小鼠，并巧妙地避开了小鼠在HCV 复制环节可能存在的缺陷，为HCV 中和抗体测试和疫苗的研发提供了有效的研究工具。

该小鼠模型仍然不支持HCV 的复制和包装。这可能是由于小鼠肝细胞中缺少了某种必需的人源因子，也可能是由于小鼠肝细胞中存在某种限制性因子。Long 等[30]的研究结果表明，小鼠肝细胞中并不存在阻碍HCV 组装和释放的限制性因素，更有可能的是小鼠肝细胞中缺少了某种人肝细胞中特有的支持HCV 复制的分子，也可能是HCV 不能有效地阻断小鼠的宿主免疫反应，比如NS3 对小鼠线粒体抗病毒信号蛋白的切割[31]。如何鉴定出关键的人源宿主因子，解决HCV 在小鼠肝细胞中复制的障碍，将是下一步关注的问题。

4 总结与展望

实验动物模型是研究HCV 病毒学、病理学、免疫学、药物和疫苗研发中重要的手段。由于与人类的高度相似性，黑猩猩作为HCV 的动物模型具有无与伦比的优势。但出于价格、道德伦理等方面的考虑，黑猩猩的使用正受到越来越多的限制。在其他动物模型中，小鼠模型应用最广泛，发展最快。尽管技术的发展已经能在免疫缺陷小鼠上同时移植人的肝细胞和造血干细胞及胸腺组织，但人源化嵌合型小鼠模型仍有许多问题有待解决，如嵌合型小鼠的肝脏非实质细胞仍然是鼠源的，部分人源造血免疫细胞如B 淋巴细胞等在小鼠体内的发育仍有障碍。这些缺陷限制了该模型在HCV 发病机制研究上的应用，近年来发展迅速的成体干细胞分化研究将有可能推动人源化小鼠模型的完善和优化。表达人源HCV 宿主因子的转基因小鼠模型代表了小鼠模型的另外一个重要方向。尽管目前的HCV受体转基因小鼠已经可以支持HCV 的侵入，但在复制和病毒组装分泌上还有缺陷，仍有待发现更多的在这两个环节起关键作用的人源宿主因子。HCV 树鼩模型目前还不够稳定，尚不能建立高效的、重复性好的感染。但考虑到其在进化上比小鼠更接近人类，加之我国在树鼩资源和饲养繁殖上的优势，因此我国应该积极探索发展HCV 树鼩模型。

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