Pim-3在非小细胞肺癌中的表达及临床意义探讨

倪志强 方艳秋 谭岩

近年来，肿瘤的发生率明显增高，严重影响人们的生命安全和生活质量。虽然肿瘤的治疗方法不断提高，但其病死率仍然居高不下。非小细胞肺癌化疗敏感性较小细胞肺癌差，且发现时多为晚期，患者的预后较差，故寻找有效的靶向治疗具有重要的临床意义。Pim家族是一组参与钙调节的相关蛋白激酶，Pim蛋白具有抗凋亡的作用，Pim-3作为Pim家族的新成员，已有基础研究证实其与肺癌A549细胞的凋亡明显相关[1]，但Pim-3与临床非小细胞肺癌的相关性未见报道，故笔者对Pim-3在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年1月～2012年5月的非小细胞肺癌标本40例（男26例，女性14例），年龄37～78岁，平均65岁。所有患者手术前均未接受放疗、化疗、生物治疗或其他抗肿瘤治疗；其中腺癌17例，鳞癌23例；分化程度：I级11例，II级9例，III级10例，IV级10例；有淋巴结转移者25例，无淋巴结转移者15例。选择我院同期因肺脓肿或肺外伤手术患者40例的正常肺组织作为正常对照组。

1.2 免疫组化法检测肺组织Pim-3蛋白的阳性表达 石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min×2次；5%～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h或4℃过夜；PBS冲洗，5min×3次；滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10～30min；PBS冲洗，5min×3次；滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min；PBS冲洗，5min×3次；显色剂显色3～15min（DAB）；自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。细胞质和细胞膜上的棕黄色颗粒为Pim-3阳性表达，光学显微镜下计数阳性细胞占所有细胞的百分比。

1.3 流式细胞术检测肺组织中凋亡细胞百分比 手术标本分离单细胞悬液，经Annexin V与核酸染料标记后采用流式细胞仪测定肺组织中细胞凋亡率。具体步骤：取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。使用冷的PBS缓冲液洗细胞2次，再用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106/mL的悬液。Falcon试管中加入100μ L细胞悬液。按体积加入Annexin V与核酸染料。轻轻混匀，室温（20℃～25℃）避光处放置15min。各实验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400μL。1h内上流式细胞仪测定结果。

1.4 Pim-3阳性表达与肺癌临床病理特征的相关性 比较不同临床病理特征肺癌组织中的Pim-3的阳性率，判断Pim-3阳性表达与肺癌临床病理特征的相关性。

1.5 统计学方法 所有数据采用SPSS13.0统计学软件进行处理，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异性比较采用t检验，计数资料以百分比表示，组间差异性比较采用χ2检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肺组织中Pim-3的阳性率 非小细胞肺癌组织中Pim-3的阳性率高达87.5%（35/40），明显高于正常肺组织中Pim-3的阳性率5%(2/40)，P＜0.05。

2.2 不同肺组织中细胞凋亡率 非小细胞肺癌组织中细胞凋亡率明显低于正常肺组织（22% vs 55.8%，P＜0.05）。

2.3 Pim-3阳性表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性 Pim-3的阳性表达与非小细胞肺癌患者的性别（男性87.3%，女性86.9%）、年龄（≥60岁患者85.0%，＜60岁者88.4%）、肿瘤大小（≥3cm 88.1%，＜3cm 83.2%）、肿瘤病理类型（腺癌89.2%，鳞癌85.4%）无关，与肿瘤分化程度（I+II期56.5%，III+IV期90.2%）和淋巴结转移密切（无淋巴结转移组43.9%，有淋巴结转移组91.6%）相关。

3 讨论

Pim-3基因位于人类染色体22q13，为35 600 bp长度[2]，其mRNA表达于大脑、心脏、肾脏、脾脏、胎盘、骨骼肌及外周血白细胞，在结肠、胸腺、肝脏及小肠正常组织中不表达[3]。目前研究表明，Pim-3可能通过以下途径发挥生物学作用：(1)调控Bcl-2家族的抗凋亡蛋白或抑制凋亡基因Bad和G6-1，抑制细胞凋亡；(2)激活CDC25A，促进细胞的G1进程，抑制C-TAK1的活性，促进G2/M的转换；(3)激活STAT-3信号途径，促进G2/M进程；(4)抑制磷酸酶活性，阻止细胞凋亡[4]。本文采用免疫组化方法检测了非小细胞肺癌组织和正常肺组织中Pim-3的阳性率，结果显示非小细胞肺癌组织中Pim-3阳性率明显增高，提示Pim-3的过表达参与了非小细胞肺癌的发生和发展。进一步凋亡率检测结果提示，肺癌组织中的细胞凋亡率明显低于正常肺组织，说明Pim-3通过调控细胞的凋亡率参与肺癌的发生发展，与上述研究结果相似。同时，本文对Pim-3阳性率与肺癌的临床病理特征进行了进一步的分析，结果显示Pim-3阳性率与患者性别、年龄、病理类型无关，而与肿瘤分化程度及淋巴转移密切相关，证实Pim-3的生物活性与细胞的凋亡密切相关，其具体机制有待进一步研究。

综上所述，Pim-3可以成为非小细胞肺癌靶向治疗的目的基因，随着科学技术的不断成熟及临床研究的不断发展，有望为提高非小细胞肺癌疗效提供理论依据。

[1]罗强，熊畅，熊珊，等.Pim-3在肺癌组织中的表达[J].华南国防医学杂志，2012，26（1）：16-18.

[2]孙守亮，钱军.pim-3基因及其相关作用[J].国际肿瘤学杂志，2012，39（2）：105-108.

[3]Fujii C,Nakamoto Y,Lu P,et al.Aberrant expression of serine and threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines[J].I nt J Cancer,2005,114(2)：209-218.

[4]Bachmann M,Moroy T.The serine/threonine kinase Pim-1[J].Int J Biochem Cell Biol,2008,37（4）：726-730.