HPLC-ELSD法测定酸羊奶中水苏糖含量

宋娟娜， 陈 合， 王长凤， 舒国伟

(陕西科技大学 生命科学与工程学院，陕西 西安 710021)

0 引 言

水苏糖(stachyose)是自然界存在的一种功能性低聚糖，其结构式为：D-吡喃半乳糖基α-1,6-D-吡喃半乳糖基α-1,6-D-吡喃葡糖基α-1,2-β-D-呋喃果糖苷，属于蔗糖的衍生产物，是棉子糖的同系物，分子式为C24H42O21.纯水苏糖为白色粉末，甜度约为蔗糖的22%.它具有能量值低，稳定性好等特点[1]；还具有增殖双歧杆菌，调节肠道菌群，保护肠道；增强人的肌体免疫力，预防疾病发生；防止体内胆固醇积蓄，降低血压；合成B族维生素，促进对某些无机盐的利用等功能[2-4].因此成为日本和欧洲等地流行的功能性保健食品[5].

课题组在前期研究中将不同量水苏糖添加到羊奶中，发酵制得水苏糖酸羊奶.本研究利用HPLC-ELSD法测定发酵后水苏糖的含量，求水苏糖利用率；以寻求利用率低，但促进普通酸羊奶益生菌菌数增值效果好的水苏糖添加量，为制备高品质高营养价值的发酵酸羊奶提供试验依据.实验结果表明该方法简便、准确、重复性好，为后期研究羊奶发酵酸奶中水苏糖含量测定提供方法.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪和蒸发光散射检测器waters1525-2420；美国Waters公司：Empower2色谱工作站；水苏糖对照品，美国sigma公司；甲醇、乙睛均为色谱纯；超纯水和酸羊奶样品，实验室自制.

1.2 试验方法

(1)色谱条件 色谱柱：Hypersil NH2色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，流动相：甲醇∶水(83∶17)，流速 1 mL/min；ELSD检测器参数：漂移管温度85℃，氮气压力35 Psi，增益10.

(2)对照品溶液的制备 精密称取水苏糖对照品0.031 3 g，置于 50 mL量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.626 mg/mL的对照品储备液，经 0.45μm滤膜滤过，备用.

(3)供试样品溶液的制备 发酵制备水苏糖添加量分别为0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的酸羊奶，分别准确量取1.5 mL制备的酸羊奶于离心管中，在高速离心机中15 000 r/min离心30 min，取出上清液继续离心一次至上清液澄清，取1 mL上清液用超纯水定容至10 mL的容量瓶中，摇匀，过0.45μm滤膜，即得4份供试样品溶液.

(4)阴性对照溶液的制备 发酵制备不添加水苏糖的阴性酸羊奶适量，依供试品溶液的制备法，制备阴性对照溶液.

(5)活菌数的测定 采用高层琼脂法[6].

2 结果与讨论

2.1 专属性实验

在上述色谱条件下，分别取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图.结果表明供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，阴性对照无干扰.水苏糖可与酸羊奶中其它组分在10 min内有效分离，且峰形较好.色谱图见图1～图3.

图1 水苏糖供试样品的色谱图 图2 水苏糖对照品的色谱图 图3 阴性对照的色谱图

2.2 线性关系考察

吸取配制好的对照品溶液4，8，12，l6，20μL，按上述色谱条件测定峰面积值，以峰面积的自然对数为纵坐标，以对照品溶液进样量为横坐标，绘制标准曲线，结果显示，水苏糖在进样量2.504～12.52μg范围内线性关系良好，其回归方程为：y=12.204x-47.478，R2=0.999 8.

2.3 精密度试验

吸取对照品溶液20μL，重复进样 6次，测定峰面积值，计算精密度RSD为2.0%.

2.4 重复性试验

取制得的同一批含水苏糖酸羊奶，按供试样品溶液的方法平行制备6份，均进样20μL，纪录峰面积，求得6份水苏糖浓度的RSD为1.01%.

2.5 稳定性试验

取上述供试品溶液0、2、4、6、8、10 h，室温放置，各精密进样20μL，测定水苏糖浓度的RSD为1.05%.结果说明供试样品溶液在 10 h内稳定.

2.6 加样回收率试验

分别量取1.5 mL已知含量的酸羊奶(添加1.0%水苏糖)9份，每3份分别精密加入上述对照品溶液4 mL、12 mL和20 mL ，即加入2.5 mg、7.5 mg和12.5 mg水苏糖对照品；按前面供试样品溶液的制备方法制备，进样20μL，测定水苏糖峰面积计算回收率，结果显示：平均加样回收率为98.59%，RSD(%)为1.53%.

表1 加样回收率实验结果

2.7 供试样品测定

分别吸取4份供试样品溶液20μL，在上述色谱条件下进样，每份平行测定3次，求的平均值.供试样品的水苏糖含量、利用率及活菌数结果见表2.

表2 样品测定结果(n=3)

2.8 讨论

(1)流动相选择： 通过实验比较了几种不同的流动相：乙腈∶水为70∶30；甲醇∶水为70∶30；甲醇∶水为75∶35；甲醇∶水为83∶17等.结果表明，乙腈∶水体系需要的保留时间为17.5 min，且分离效果差，很难将样品中的水苏糖与其它成分分开；以甲醇∶水为70∶30和甲醇∶水为75∶25为流动相时，水苏糖与其它成分分离效果差；以甲醇∶水为83∶17为流动相时，分离效果最好.

(2)ELSD参数的选择： 主要为漂移管温度和雾化气体压力的选择.漂移管温度必须足够高以保持溶剂雾化状态，否则检测器噪声太大，但也不能过高造成样品蒸发，导致灵敏度降低；另外，为保证雾化后的色谱洗脱物能够均匀的进入检测池，避免大量微滴导致噪声升高，因此要求保证气体压力足够高.故选用漂移管温度85 ℃，气体压力35 Psi，此时，噪音小，信号强.

3 结论

选用ELSD-HPLC法测定酸羊奶中水苏糖含量，在上述色谱条件下，水苏糖的线性范围为2.504～12.52μg，相关系数为0.999 8.本方法操作简便、稳定，结果准确、灵敏度高、重现性好.实验结果显示，在羊奶中添加0.60%水苏糖制备的酸羊奶，水苏糖的利用率最小，活菌数最高，促进益生菌生长效果最好.

参考文献

[1] 舒国伟，吕嘉枥，任宏强，等．水苏糖对乳制品中微生物的影响[J]．食品科学，2005，26(6)：106-108．

[2] 刘薇薇，李小伟．一种功能性化妆品原料-水苏糖[J]．应用科技，2008，16(13)：24-25．

[3] 任宏强．水苏糖[J]．精细与专用化学品，2003, (14)：15-17．

[4] 邓文辉．水苏糖的功效及应用研究概述[J]．综述与述评，2010，13(8)：19-22．

[5] 袁其朋, 范 颖. 水苏糖[J]. 精细与专用化学品, 2002, 10(1)：13.

[6] 熊 郃.C.B.T三种菌混合发酵益生菌酸奶发酵基本特征研究[J].乳品科学与技术，2008，(2)：56-58.