ClassⅠ新城疫病毒概述

金仕强，孟春春，仇旭升，于圣青，丁 铲，左之才

（1.四川农业大学动物医学院，四川 雅安 625014；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）完整的病毒粒子由囊膜、核酸及核衣壳组成，近圆形，直径介于120nm～300nm，在囊膜的外层呈放射状排列的突起物称纤突。NDV的基因组为不分节段、单股负链RNA，全长有15186、15192和15198个核苷酸3种形式[1]，其中前两种基因长度NDV属于ClassⅡ，第3种基因组长度NDV属于ClassⅠ。ClassⅠNDV广泛存在于野生水鸟、家养水禽及活禽交易市场，在分子水平上与ClassⅡNDV存在较大的差异。Class I毒株非常特殊，意义重大。在实验室条件下，于圣青等[2]将一株ClassⅠ新城疫病毒经过气囊盲传9代后，再经过大脑盲传5代，使得原本毒力为弱毒株的NDV，变为强毒力毒株，可以引起鸡群100%的发病和死亡；另外，中国农业科学院上海兽医研究所禽病实验室也将分离到的一株ClassⅠ新城疫病毒经气囊盲传10代，使得该毒株由原来的弱毒株变为强毒株（文章另外报道）。这种经过气囊传代使得毒力变强的模式是所有新城疫病毒的共性，还是只是ClassⅠ新城疫病毒的特性或者只是少数ClassⅠ新城疫病毒毒株的特性？这些毒力返强毒株会不会是造成下一次新城疫大流行的元凶呢？本文就ClassⅠNDV的研究进展作简要综述，以为研究新城疫病毒提供参考。

1 ClassⅠNDV的发现

ClassⅠNDV最早发现于2003年，Aldous E W等根据与单克隆抗体的结合模式，将其列入“Lineage 6”，该群体NDV与其他群体的平均差异为50%[3]。匈牙利研究人员 Czegle'di A 等[1]根据基因组长度、F基因和L基因序列，对分离自世界各国的67株NDV进行遗传进化分析时，首次将NDV分为ClassⅠ和ClassⅡ两个分支，并首次对ClassⅠNDV中的DE－R49／99毒株进行全基因测序，其全基因组长15198bp。随后，在美国、韩国、日本、中国香港等国家和地区相继都发现ClassⅠNDV的存在。2008年，我国动物卫生与流行病学中心研究人员刘华雷等[4]从江苏省某表征健康的家鸭群中分离到国内的第一株的ClassⅠNDV08－004。

2 致病性

目前有关ClassⅠNDV的报道中，绝大多数为弱毒株，其最小致死量鸡胚平均死亡时间（MDT）均大于96，1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）均小于0.5。而强毒株只发现了2株，第一株为导致爱尔兰1990年暴发新城疫的元凶，这也是至今为止报道的惟一一株造成新城疫流行的ClassⅠNDV强毒株[5]；第二株为于圣青等[2]在实验条件下，将一株ClassⅠNDV，通过雏鸡传代后，使得毒力由原来MDT＞120h，ICPI＝0，IVPI＝0，变为 MDT＝56 h，ICPI＝1.88，IVPI＝2.67，对鸡可造成100%的致病，呈现强毒株NDV毒力。

3 ClassⅠNDV的基因组及结构蛋白特性

3.1 ClassⅠNDV的基因组

ClassⅠNDV的基因组全长为15198bp，符合NDV基因组的“六碱基规则”。与ClassⅡNDV基因组为15186bp的毒株相比，ClassⅠNDV在P基因的495bp～496bp处多出TGGGAGACGGGG12个碱基（编码的多肽为 WETG）；与基因组为15192bp的ClassⅡNDV毒株相比，除了在上述位置多出12nt外，在NP基因的非编码区1647～1648处少了6nt，相差的6nt因毒株不同而略有不同。多出的12nt或相差的6nt的具体功能和生物学意义，目前尚无明确的定论。

3.2 ClassⅠNDV的结构蛋白

ClassⅠNDV的全基因组与ClassⅡNDV一样，基因序列为：3'－NP－P－M－F－HN－L－5'，依次编码核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphor protein，P）、基质蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、血凝素－神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin－neuraminidase protein，HN）及大分子蛋白（large protein，L）。就目前报道的序列而言，ClassⅠNDV间的全基因序列和各基因片段及推导出的氨基酸序列同源性均较高，其中以L基因和L蛋白同源性最高，HN基因和P蛋白同源性较低，与ClassⅡNDV全基因组序列和各基因片段及推导出的氨基酸序列相比，两分支间的同源性均较低。

编码ClassⅠNDV的NP蛋白的基因全长1747bp，ORF 1470bp，编码489个氨基酸，与ClassⅡNDV相比，与全基因组为15186bp中的NP蛋白基因组长度一致，但与全基因组为15192 bp的毒株相比，在非编码区1647～1648处少了6 nt。ClassⅠNDV的NP基因与ClassⅡ的同源性均较低，就发表的序列比较后可以看出，两大类NDV间的同源性均小于80%。刘晓文[6]对已发表的ClassⅠNDV及常见的ClassⅡNDV的NP基因末端序列进行比较，结果发现ClassⅠNDV为TTA GAA AAA AA，而 ClassⅡNDV 为 TTA GAA AAA AG，两者相差一个碱基。NP蛋白与病毒的转录、复制等有关。

编码P蛋白的基因全长1463bp，比ClassⅡNDV的长12nt，ORF 1200bp，编码399个氨基酸。同样，ClassⅠNDV的P基因与ClassⅡ的同源性均较低，陈云霞等[7]对分离的一株ClassⅠ新城疫病毒P基因进行了比较分析，结果表明与ClassⅡNDV的同源性在70.8%～72.4%之间。P蛋白是由于被高度磷酸化而得名，与L蛋白一起构成RNA聚合酶（P－L），对新城疫病毒RNA的合成起调节作用。P蛋白与RNA合成密切相关，同时作为NP蛋白的分子伴侣阻止未组装的NP蛋白对非新城疫病毒RNA分子及mRNA的“非法”衣壳化。

编码M蛋白的基因全长1241bp，这与ClassⅡNDV一致，ORF 1095bp，编码364个氨基酸。M蛋白具有多种生物学功能：保护病毒粒子；通过与细胞膜、核衣壳间的相互作用，参与病毒的组装与出芽，形成具有感染性的病毒粒子；另一方面也可以抑制宿主细胞RNA的转录和蛋白质的合成，与病毒的致病性有关。

编码F蛋白的基因全长1792bp，ORF 1662 bp，编码553个氨基酸，长度与ClassⅡNDV的F蛋白一致，但与ClassⅡNDV的同源性性较低。F蛋白以非活性的F0形式存在，需经历特异性的裂解修饰过程，才能介导病毒与细胞膜的融合。F0蛋白裂解能力在一定程度上决定NDV的毒力，毒株因毒力不同而裂解位点不同。目前研究结果表明，多数强毒裂解位点处氨基酸残基为112R－R－Q－P／KR－F117；ClassⅡNDV 弱毒株多为112G－R／K－Q－GR－L117，而 Liu X 等[8]和 Kim LM等[9]报 道 了ClassⅠNDV 弱毒株为112E／G－R／Q－Q－E／G／D－RL117，增加了112位、113位、115位氨基酸的多样性。大多数ClassⅡNDV的F蛋白具有12个保守的半胱氨酸残基，分别位于第25、76、199、338、347、362、370、394、399、401、424及523位，但王伟伟[10]在对某弱毒株ClassⅠNDV分析时，发现25位的半胱氨酸变为蛋氨酸，并且与参考的ClassⅠNDV一致，这也就表明，25位的半胱氨酸变为蛋氨酸是ClassⅠNDV的特性。

编码HN蛋白的基因全长2001bp，因终止密码子不同，编码的氨基酸长度不同，现已发现有570、572、574、580、585及616个氨基酸的 ClassⅠNDV 毒株[11－12]，除了两株强毒外，其余均为弱毒株，这与ClassⅡNDV间有明显的不同；而在ClassⅡNDV中发现有571、572、577、581和616个氨基酸的毒株。这些HN蛋白差异明显的NDV间除了毒力有差异外，其他的生物学特性还有什么不同？目前还未见有相关的报道。HN蛋白主要有以下功能：血凝素成分负责识别易感细胞的含唾液酸的受体并使病毒粒子与之吸附；而神经氨酸酶则催化唾液酸受体水解，并促进病毒囊膜与细胞膜以及细胞与细胞的膜融合，从而促进新生的病毒粒子从感染细胞表面释放，因此HN蛋白与毒力有着密切关系。近年来的研究表明，F蛋白的融合作用还需要HN蛋白的参与才能进行。

编码L蛋白的基因全长6703bp，ORF 6615 bp，编码2204个氨基酸，是NDV中最大的蛋白，但在NDV中的含量很低，位于核衣壳内，与P蛋白一起构成RNA依赖的RNA聚合酶，形成具有完整酶活性的复合物。在L蛋白上存在参与RNA转录和复制的大部分酶，包括RNA多聚酶、mRNA加帽酶、甲基转移酶和磷酸激酶等。同时，L蛋白与病毒的毒力也有一定的关系。

4 ClassⅠNDV的基因分型及分子流行病学

4.1 ClassⅠNDV的基因分型

虽然NDV只有一个血清型，但在分子水平上根据基因组长度和F、L基因的序列可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类，并且这两类NDV在抗原和遗传上都存在较大差异[1]。Kim LM等[9]根据F基因374 bp的序列，对290株弱毒株进行遗传分析时，首次将ClassⅠNDV分为1～9这9个基因型。

4.2 ClassⅠNDV的分子流行病学

2005年匈牙利研究人员Czegle'di A[1]发现了ClassⅠNDV毒株以来，世界各地相继都有ClassⅠ毒株的报道，并且流行毒株的基因型呈现一定的区域性。到目前为止，分离到的ClassⅠNDV主要来自于全世界范围的水禽、海鸟及活禽市场的泄殖腔棉拭子，偶尔在鸡群泄殖腔中分离到。

Kim L M等[9]通过扩增1986年－2005年间分离至北美地区健康水禽和水鸟的268株弱毒NDV的F基因片段（374bp），进行遗传进化分析，结果表明，ClassⅠNDV的分离率达71.5%（192／268），1～9型分别为9、14、0、12、81、2、44、6、24株，这表明北美地区的ClassⅠNDV以基因5型和7型为主，没有基因3型。随后该研究人员又对来自中国香港活禽交易市场的表征健康活禽的泄殖腔棉拭子及环境中共分离到23株NDV，其中ClassⅠNDV占91.3%（21／23），对 F基因374bp进行遗传进化分析，结果表明这21株ClassⅠNDV属于基因3型。Lee E K等[13]对2006年－2007年间分离自韩国鸭场的14株病毒进行分子流行病学调查时，发现有1株属于ClassⅠNDV，属于基因2型，并且该分离株病毒与分离至北美、德国、丹麦等国家的基因2型毒株有很高的同源性。

在国内，Liu H等[4]从表征健康的家鸭中分离到第一株ClassⅠNDV，扩增F基因的主要功能区片段进行遗传进行分析，结果表明该毒株属于ClassⅠ中的基因3型。随后该研究人员又报道了从南方地区的健康家鸭中分离到一株ClassⅠNDV，经F基因47bp～420bp的遗传进化分析，表明该株ClassⅠNDV 属于基因2型[14]。Liu X等[8]报道了2002年－2007年间从山东、江苏、河南、安徽、浙江、福建、上海七省的健康家鸭泄殖腔采集的棉拭子中分离到30株ClassⅠNDV，经应用F基因47bp～420bp绘制的遗传进化树分析，结果显示，12株属于基因2型，18株属于基因3b型。

总的来说，ClassⅠNDV主要流行于野生水鸟、家养水禽及活禽交易市场；分子流行病学方面：北美地区的ClassⅠNDV以基因5型和7型为主，有少量的基因1型、2型、4型、6型、8型及9型，但没有基因3型的发现；而亚洲地区包括韩国、中国香港及中国大陆等的ClassⅠNDV以基因2型和3型为主。

5 ClassⅠNDV的检测

5.1 病毒的分离及初步鉴定

目前，新城疫病毒的分离及鉴定仍然是诊断新城疫最为准确的方法。将采集的样品接种9日龄～11日龄的鸡胚后，测定尿囊液的HA和HI，同时用禽流感、EDS－76等标准血清进行HI试验，综合进行判定。

5.2 分子水平上的鉴定

在分子水平上，由于ClassⅠNDV和ClassⅡNDV在分子上存在较大的差异，用常规鉴定ClassⅡNDV的方法来鉴定ClassⅠNDV，多以失败告终[15]。最早用于鉴定ClassⅠNDV的是单克隆抗体技术，Aldous E W等[3]根据与特定单克隆抗体的结合模式，将其列入“Lineage6”，该群体分离的NDV毒株与其他群体分离株的平均差异为50%，后来证实该群体为ClassⅠNDV。孙英杰等[16]用ClassⅠNDV毒株9a5b作为抗原免疫接种小鼠，用间接免疫荧光法进行单克隆抗体的筛选，结果制备了仅对Oya株、9a5a株、D74株、D55株等ClassⅠNDV有反应，而对F48E9株，La Sota株、D72株、I2株、ZJ1株、D1株等ClassⅡNDV无反应的单克隆抗体2A8、3H7、3H9。

目前，常根据GenBank上已发表的ClassⅠNDV核苷酸序列，设计针对ClassⅠNDV毒株特异性的引物进行鉴定。

Kim LM等[17]应用 Wise MG等[18]建立的针对M基因设计的用于鉴定NDV的探针，对分离自中国香港的ClassⅠNDV进行检测，结果使得大多数的ClassⅠNDV毒株未被检测出，该研究人员又改用针对L基因设计的探针，结果可以检测出所有的ClassⅠNDV（22株）。随后该研究人员又对50株弱毒NDV（42株ClassⅠ，8株ClassⅡ）分别应用针对M基因和L基因引物进行RRT－PCR检测，结果表明，应用M基因进行检测时，三分之二（30／42）的ClassⅠNDV不能被检测出，但用针对L基因的引物进行检测时，所有的ClassⅠNDV均能检测出[9]。Kim LM等[19]根据 ClassⅠNDV L基因保守区设计引物，进行RRT－PCR，从而建立了一种能鉴别ClassⅠNDV的方法。通过该方法，可以对所有的ClassⅠNDV基因型毒株（共108株，涉及基因型1～2及4～9）进行检测，并且可以从ClassⅠ基因5型和ClassⅡ基因Ⅱ型的混合NDV中检测到ClassⅠNDV的存在；敏感性方面，可以检测到ClassⅠNDV中基因5型、7型、8型的RNA≤1fg的样品。

国内研究人员Liu H等[20]根据F基因（包括F蛋白裂解位点）设计引物，建立了一种区分和检测ClassⅠ和ClassⅡNDV高度敏感性和特异性的多重RT－PCR方法。该方法只能检测到NDV毒株（包括ClassⅠ和ClassⅡNDV的毒株），而对IBDV、IBV及禽流感病毒中的H5、H7、H9亚型没有交叉反应。

6 展望

ClassⅠNDV最初分离自野生水鸟和水禽，但随后就在活禽交易市场的鸡群中分离到，这表明NDV可以在水禽和家禽间相互传播；另一方面，ClassⅠNDV可以在一定的实验条件下演变为强毒力毒株，导致鸡群100%的发病和死亡，那么在自然条件下，ClassⅠNDV是否也可以演变为强毒力毒株，并导致ND的大流行？为了更好的防治ND，减少因ND造成对养禽业的损失，因此，有必要加强对ClassⅠNDV的检测及ClassⅠNDV毒力演变等相关研究，尽可能消除这种潜在暴发新城疫的隐患。

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