新城疫病毒结构蛋白功能及检测技术研究进展

邹海涛，兰邹然，姜 平

（1.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2.山东省动物疫病预防与控制中心，山东 济南 250022）

新城疫（Newcastle disease，ND），又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟，是一种由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以呼吸道和消化道黏膜出血为特征性病变的烈性传染病。ND具有高度接触传染性，传播速度极快，急性发病时病死率接近100%，严重危害家禽养殖业，故世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病之一。在我国，ND的暴发和流行虽已得到较好的控制，但是NDV不同毒株间毒力有较大差异，且在高免疫压力下，随着时间推移病毒也随之发生着一定的变异，给NDV检测工作带来了困难。传统的病原分离鉴定以及血清学检测费时费力，且具有一定局限性。随着分子生物学技术的快速发展，NDV检测技术也得到了长足发展，但是这些新技术在实际应用中都存在一定的缺陷或弱点。因此，深入研究NDV各部分结构及其功能，进而改进现有检测技术或开发新的检测技术已成为目前ND防控工作的一个重点。

1 新城疫病毒的结构

新城疫病毒属副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），病毒粒子外有囊膜，囊膜表面有纤突，其基因组为一长约15kb的单股负链RNA。NDV不同毒株其基因组大小略有差异，但各毒株的基因组碱基数均为6的倍数，这种6碱基机制对NDV的复制有着至关重要的作用[1]。NDV的基因组不分节段，编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷酸化蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素－神经氨酸酶蛋白（HN）以及具有RNA依赖性的RNA聚合酶蛋白（L）。P、NP和L称为内部蛋白，与病毒RNA组成核糖核蛋白体（RNP）；M、F和HN则称为外部蛋白。

1.1 NP蛋白

NP蛋白是一种与病毒的增殖密切相关的病毒多肽，对病毒核衣壳的形成至关重要[2]。NP蛋白带有大量电荷，而由大量碱性氨基酸构成的M蛋白带有强正电荷，二者通过电荷相互作用，将RNP准确的包装入病毒粒子中。虽然NP蛋白不能对NDV的感染和毒力起决定作用，但NP蛋白与基因组RNA共同组成NP－RNA复合体，作为复制和转录的模板，包含免疫显性抗原决定簇，具有高度的免疫原性[3]，能够介导细胞免疫作用。NP蛋白mRNA的3＇非编码区在强弱毒株间表现出相当大的差异，但能否作为强弱毒判定的标准目前尚无定论。

1.2 P蛋白

P蛋白可与L蛋白形成复合物，产生酶活性。P蛋白作为NP蛋白的分子伴侣能够阻止NP蛋白在合成之后发生自动装配的特性，防止NP蛋白对非NDV RNA进行衣壳化。P基因在转录过程中会发生RNA编辑现象，形成2种衍生蛋白V和 W。V蛋白与NDV的复制和组织嗜性有关，对干扰素有颉颃作用，从而影响NDV的毒力。这种颉颃作用主要与V蛋白位于两端的4个氨基酸位点有关[4]。此外，W蛋白对NDV的生物活性也有重要的作用[5]。

1.3 M 蛋白

M蛋白是存在于病毒囊膜内层的一种非糖基化蛋白，在病毒装配的过程中对病毒囊膜的形成、核衣壳与囊膜之间的识别、维持病毒粒子结构完整性有着重要的作用。一系列分子流行病学调查结果显示M蛋白在不同的NDV分离株中具有极高的保守性。M蛋白还可抑制宿主RNA转录和蛋白质的合成，与病毒的致病力有关。Yin R F等[6]借助RNA干扰技术对M基因的第641和第827碱基位点进行特异性沉默，结果发现病毒复制能力明显降低。若NDV毒株M基因发生突变，则该毒株在宿主体内不能出芽，仅表现为持续性感染。

1.4 F蛋白

F蛋白以纤突形式呈现在囊膜以外，是NDV最重要的毒力蛋白和保护性抗原。不同毒株的F基因序列存在差异，差异越大，毒株间的亲缘关系越远。F蛋白参与NDV与靶细胞作用的过程，使病毒囊膜与宿主细胞膜融合，从而使病毒能穿过宿主细胞膜进入胞浆，脱去核衣壳进行复制。在这个过程中，F蛋白跨膜区特异性序列起着相当重要的作用，它能够影响胞外区活化前的构象以及F蛋白与HN蛋白的相互作用，调节融合活性[7]。

F蛋白最初是以一种无活性的前体蛋白F0的形式被合成，F0的C端嵌入病毒囊膜之中，而后被细胞内的胰蛋白酶在第112～117位氨基酸残基处裂解为F1和F2。F1多肽N端插入宿主细胞的脂质层继而发挥活性作用，启动膜融合，NDV才产生感染性。以往普遍认为该裂解位点的氨基酸序列及裂解能力是NDV毒力的惟一决定性因素。不过近年来的研究表明F蛋白的裂解能力并不是NDV毒力的惟一决定性因素[8]。国外学者通过反向遗传技术将NDV高致病性毒株与非致病性毒株的NP、P、M、L编码区进行相应置换，而后将拯救出的病毒接种动物，同时将重组的病毒基因组转染单层细胞，以评估重组病毒的致病力与复制能力。结果发现原强毒株重组后，病毒的复制能力降低，致病力有明显的减弱，相比之下无致病力毒株则呈现了相反情况，特别是在置换了NP、P和L等3个编码区后，病毒复制能力明显增强，致病力变为原先的10倍[9]。说明真正决定NDV毒力的因素是病毒的复制能力，并非仅仅是F蛋白的裂解能力。

1.5 HN蛋白

HN蛋白是一种既有血凝素（HA）活性又有神经氨酸酶（NA）活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保护性抗原。HA活性能够使病毒吸附到对应靶细胞的受体上，NA活性则破坏细胞受体，从感染细胞表面释放病毒粒子。同时HN蛋白还能够促进膜融合，吸引F蛋白充分接近该位点，继而启动病毒与细胞膜融合。HN蛋白mRNA的5＇非编码区（UTR）是NDV毒力的影响因子之一，若将其缺失，NDV复制不会受到影响，但却可以降低病毒的致病力[10]。此外，若 HN 蛋白第526位氨基酸发生突变，HN蛋白的活性将会减弱，NDV的复制将会受其影响，致病力降低[11]。HN蛋白N末端胞内区的5个氨基酸位点（第1、2、3、4、6位）对病毒与细胞的融合、病毒毒力以及HN蛋白和M蛋白的定位有着极其重要的作用[12]。这一系列研究表明，病毒的组织嗜性依赖于HN蛋白，故HN蛋白是NDV致病力的必需因子，与F基因共同决定着NDV的毒力强弱，进一步印证了F蛋白裂解能力不是NDV毒力唯一决定因素的结论。

1.6 L蛋白

L蛋白是RNA依赖性的RNA聚合酶的主要组成部分，且参与RNA转录和复制的大部分酶的活性都来源于L蛋白。秦红刚等[13]通过RNA干扰技术对位于NDV L基因上的P1595、P2103、P3277等3个酶活性中心区域进行沉默。结果发现特异性的沉默这3个区域的表达会抑制病毒的复制，影响子代病毒粒子的组装和释放，说明了P1595、P2103和P3277这3个区域对于L蛋白发挥RNA依赖的RNA聚合酶的功能具有重要的作用。此外，国外学者借助反向遗传学技术发现L基因可影响病毒复制能力，进而影响NDV的致病力[14]。

2 新城疫病毒的检测技术

2.1 RT－PCR技术

RT－PCR检测技术具有快捷、灵敏、特异性强等优点，消除了常规血清学诊断方法中非特异性因素的干扰及敏感性问题，得到了OIE的认可。虽然国内外已建立了许多成熟的RT－PCR方法，但是RTPCR检测技术在实际应用中出现了各种各样缺陷，因此仍然需要不断地对该技术进行改良和优化。

Liu H L等[15]根据多个NDV野毒分离株的F基因序列，设计了2对特异性引物并优化了反应条件，建立了二重RT－PCR检测方法，将NDV检测以及Ⅰ和Ⅱ型NDV的鉴别一次性完成。试验结果显示，利用此方法，Ⅰ型NDV参考毒株可扩增出433 bp的特异性条带，Ⅱ型参考毒株可扩增出535bp的特异性条带，同批检测的AIV、IBV、IBDV均无特异性扩增条带。随后他们又对67份野毒样品进行了检测，检测结果与病毒基因测序结果相一致。同样是根据NDV F基因的序列，Zhang L等[16]设计了一条通用上游引物F1和2条特异性下游引物F2、F3，进而建立了半套式RT－PCR检测方法。先利用引物对F1＋F2确定NDV的存在，进而再用引物对F2＋F3鉴定NDV毒株的毒力。经过验证，该方法的敏感度要比普通RT－PCR方法敏感1000倍。鉴于NDV感染在临床上极易与AIV感染混淆，中国农业科学院兰州兽医研究所的研究人员根据H5－AIV和H9－AIV的H基因以及NDV的F基因设计了3对特异性引物，建立了三重RT－PCR检测体系[17]。随后将该体系与传统单一RT－PCR检测体系进行对比，二者的检测结果完全一致。

2.2 荧光定量RT－PCR技术

Real－time RT－PCR技术是通过借助于荧光信号来检测PCR产物，提高了灵敏度，实现了真正意义上的DNA定量，具有广阔的发展前景。目前，该技术已被应用于包括NDV、PRRSV、CSFV等多种动物疫病检测。

Wise M G等[18]根据NDV M基因的保守序列设计了引物和水解探针，其检测敏感度可达到10 EID50。Fuller C M等[19]建立了基于L基因的Realtime RT－PCR方法，如若将其与 Wise M G等建立的方法结合，则基本上可涵盖所有Ⅰ型和Ⅱ型NDV毒株。在实际工作中，需要判定NDV分离株是否为强毒株。为此，国外在普通Real－time RT－PCR的基础上发展出了若干种多重Real－time RT－PCR体系，用以鉴定NDV分离株。Tan S W 等[20]通过分析NDV不同毒力毒株NP基因的序列，设计了2条通用引物以及2条特异性探针，采用SYBR Green I染料建立了两步法Real－time RT－PCR检测方法。经验证，该方法敏感度可达到3×105个病毒拷贝，较普通RT－PCR方法提高了10倍。同样是使用SYBR Green I染料，Nidzworski D 等[21]则是根 据NDV F基因裂解位点附近的序列设计了一套Realtime RT－PCR检测方法，对强毒株和弱毒株的敏感度可分别达到102EID50和103EID50。此外，多重荧光定量PCR体系还可用于鉴别AIV和NDV。谢芝勋等[22]根据AIV和NDV的基因保守序列，设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针，并对反应条件进行优化，建立了能够同时检测AIV和NDV的二重荧光定量RT－PCR方法，对AIV和NDV的检测敏感性均可达到2000个拷贝，比常规RT－PCR敏感性高100倍。

综合来看，荧光定量PCR技术不仅可以对样品中的病毒含量进行定量，而且灵敏度高、特异性强、准确可靠、自动化程度高、无污染。但是若待检样品数量较大时，单重荧光定量PCR的成本耗费较高，经济性偏低。因此高通量、低成本、高效率的多重荧光定量PCR检测技术更值得进一步发展和推广。

2.3 环介导逆转录等温扩增技术

环介导逆转录等温扩增（RT－LAMP）是近年来新兴的一种快速DNA扩增技术，其基本原理在于利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下对靶序列进行扩增。RT－LAMP技术具有特异性强、敏感性高、反应迅速、设备要求低等特点。目前，该技术在人类病毒性疾病的诊断领域有着广泛的应用，但是在动物病毒性疾病诊断领域尚处在尝试阶段。

Pham H M等[23]设计了一套以NDV F基因为靶基因的RT－LAMP特异性引物，仅需将反应体系水浴加热2h，即可完成检测，检测敏感度可达到0.5pg DNA，其特异性与敏感性均达到了套式RTPCR水平。陈安莉等[24]根据NDV F基因的8个区段设计了可鉴别强弱毒株的3套特异性引物，建立了可区分NDV的强弱毒株的RT－LAMP检测法，检测的灵敏度可达到0.01pg病毒RNA，是普通RT－PCR检测的100倍。

此外，通过添加Loop引物，反应速度可进一步提高，缩短约一半的反应时间；而改变反应体系中各组分浓度则可控制假阳性结果出现几率，进一步提高检测的准确性。

2.4 生物芯片技术

生物芯片技术是是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，根据点在芯片上的探针的不同分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片及组织芯片等，具有高通量、高灵敏度、自动化、微型化等特点，操作简单，成本较低。

Wang L C等[25]首先根据NDV F基因和AIV M基因的保守序列设计出通用引物，根据NDV F蛋白裂解位点和AIV HA蛋白裂解为点的序列设计出特异性探针，后进行PCR扩增制备靶基因并纯化，以点样仪将制备的靶基因点制在基片上成功制备了基因芯片。该芯片可同时检测NDV、H5和H7亚型AIV，并可对NDV进行强弱毒株鉴别，检测结果肉眼即可观察，无须借助其他设备。随后的验证试验证明该芯片具有良好的敏感性和特异性。石霖等[26]则将AIV和NDV的蛋白抗原先进行纯化，用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上，制备了国内第一种可视化蛋白芯片。芯片与待检血清杂交后，再与二抗杂交，银染显色后根据灰度值判定结果，从而实现了检测结果的可视化，使用极其方便。采用该方法对18份血清样品进行初步检测，结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交，无交叉反应，而且呈现较强可视化信号。与琼扩（AGP）抗体检测进行的符合率比较显示该可视化蛋白芯片具有很好的特异性，检测灵敏度至少为AGP法的400倍。

2.5 胶体金试纸

胶体金试纸是将单克隆抗体技术、金标（将单克隆抗体、多克隆抗体与金离子结合在一起）技术、纸上层析技术组合起来的一种新的技术，它以胶体金为显色剂，利用抗体和抗原反应原理来捕捉病毒并显色的。胶体金试纸具有快捷、敏感、准确、廉价、稳定等一系列优点。目前顶尖的科研机构和公司的产品对NDV的测定灵敏度达3×103EID50，而且部分商品化试纸条能够同时检测AIV和NDV。李蓓蓓等[27]研制的NDV－AIV复合型胶体金免疫层析检测可在10min中完成对2种疾病的检测，NDV的检测灵敏度为传统血凝血抑试验的8倍，重复性、稳定性以及特异性均达到了理想水平。因此，胶体金试纸是一种非常适合于基层NDV防控检测的技术手段。

2.6 联合检测技术

除了前文中所述技术，部分单位和机构还将多种检测技术或平台相结合，建立了一些联合检测平台，例如PCR－DHPLC（PCR－变性液相高效色谱）联合检测[28]、免疫 PCR[29]、流式微球免疫检测[30]等。这些联合检测法最大的优势在于极高的检测敏感度，其中的一些方法其敏感度可达到10－1.5ELD50／0.1mL。虽然这些方法在检测的敏感度和准确性上达到了较高的水平，但是这些方法都需要昂贵的仪器设备和试剂，检测成本较高，并且对操作人员的水平要求较高，因此并不适用于基层检测，而更适用于出入境检验检疫检测。

3 结语

近年来国内外对NDV的结构及其相应的功能的研究取得了一定的研究成果，但这仍然是需要研究者们不断探索的领域，特别是NDV的基因组学及蛋白组学。只有更进一步的搞清NDV的分子生物学特性，才能研究出更好的检测技术及防控措施。NDV的防控工作仍然任重道远。从目前国内的实际情况来看，NDV的检测应该形成更加完善的体系，可以根据不同的检测目的和要求，采取不同的检测技术措施。对于基层，可以采取低成本、设备要求低、便于操作、高准确性的检测方法，如胶体金试纸、多重RT－PCR、RT－LAMP等；而对于大面积疫病监测以及出入境检疫，则可以选择高通量、高效率、高灵敏度、高稳定性的检测平台，如荧光定量RTPCR、生物芯片、PCR－DHPLC等。

值得注意的是随着对NDV结构蛋白功能研究的深入，F蛋白裂解位点附近的氨基酸序列不再是毒力强弱的惟一判定标准。因此，具有更高适用性的NDV强弱毒株鉴别检测技术的研究工作也许将会是下一步NDV防控工作的核心内容。

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