园艺作物的ISSR分子标记研究及应用

刘淑芹，吴凤芝，刘守伟

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

20世纪80年代以来，随着分子生物学的迅速发展，园艺作物的研究已经不仅仅局限于采用传统的田间数据测量、植株病虫害调查、杂交授粉等方法，分子生物学研究方法逐渐被研究者广泛应用，其中分子标记技术在园艺作物研究中发展十分迅速。近年来，DNA分子标记技术就已广泛地应用于园艺作物的遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位、品种纯度鉴定及分子标记辅助育种等方面，如限制性片段长度多态（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、微卫星（Microsatellite）和扩增限制性片段长度多态分析（AFLP）等[1-4]。每种分子标记方法各有优点，但都有其局限性。RAPD技术的引物是随机序列，操作十分简单、快速、经济，但可重复性不够理想；AFLP技术的多态性和重复性都不错，但对实验器材和技术要求稍高，较为复杂和花费更多；SSR技术拥有高度特异性和丰富多态性并且为共显性标记，但它需要预先知道基因组的序列来设计引物，因此限制了它的应用范围；ISSR技术的出现克服了这些局限性，并很快被运用到许多植物研究领域[5-6]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat）是近年来在微卫星技术上发展起来的一种新型分子标记技术[5,7]。由于ISSR技术不仅可以快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性，有很好的重复性，而且操作简单、成本较低，适合大样本的检测，在种群遗传学、种质资源、分类学与种系发生学等方面得到迅速应用[8-10]。本文主要对ISSR标记的原理、方法、特点及其在园艺作物研究中的应用进行综述。

1 微卫星和ISSR标记

ISSR是在微卫星标记的基础上发展而来的分子标记技术。以微卫星标记的原理为基础，随着获得微卫星重复单元类型的增加，用微卫星序列直接进行PCR扩增，无需预先知道基因组序列。

1.1 微卫星

微卫星是指以少数几个核苷酸（1～5个）为单位多次串联重复的DNA序列，也称为简单序列重复（Simple sequence repeats，SSR）或短串连重复（Short tandem repeats，STR）[11]，它在真核基因组中广泛分布。微卫星主要以2个核苷酸为重复单元，也有一些为3个核苷酸，少数为4个或更多[1]。在对（GT）n、（GA）n、（GATA）n、（GACA）n重复序列进行研究的结果中发现，（GT）n重复序列的拷贝数由酵母的102拷贝到鼠类基因组的105拷贝[13]；而（GATA）n的拷贝数在鼠类基因组中约为104拷贝[14]。一般认为，微卫星的产生是DNA复制或修复过程中DNA滑动和错配或有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换的结果[15]。微卫星具有许多功能，如重组热点[16]、对基因的调节和表达[14]以及性别决定[17]等。同时微卫星具有高多态性、简单的孟德尔遗传方式，能用PCR扩增、提供高质量的信息等优点[18]，近年来已成为比较理想的分子标记方法[6]，广泛地用于种群遗传多样性分析[8]、亲子鉴定[19]、遗传图谱的构建[20]等方面的研究。

检测微卫星的多态性，必须获得所需微卫星位点，即根据已知微卫星位点的两翼序列设计引物，这可通过查找已知的微卫星引物来实现：筛选与试验物种亲缘关系较近物种的引物以及用经典分子生物学方法克隆所需的微卫星位点[21]。

最近发展了一些无需知道微卫星侧翼序列即可检测有关微卫星高多态性的方法。这是基于对SSR互补引物的使用。它是利用一系列含有简单序列重复的不同寡核苷酸[5-7]，或者与随机引物复合使用作为引物[21-23]，对基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB染色、银染或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性。这种方法与RAPD技术相似，只用一个引物，但其所用的引物是在SSR的基础上设计的非锚定引物，如引物可能的序列是（GA）10或（CGG）6，扩增的是SSR之间的DNA序列，又可称为MP-PCR（Microsatellite primed-PCR）[23]。

1.2 ISSR分子标记技术

ISSR方法是以微卫星重复序列作为引物检测物种多态性发展而来，即在MP-PCR基础上发展而来的[5]。该技术在SSR序列的5'或3'末端加上2～4个随机选择的核苷酸作为引物，如：5'端的引物为BDDA（CA）7，3'端的引物为（CA）8RY，以引起特定序列位点的退火，降低其他可能靶标退火的数目。该策略的优点是在基因组上只有与锚定的核苷酸匹配的那些位点才能被靶定，因而避免了引物在基因组上的滑动，可提高PCR扩增反应的专一性[24]。这种方法即可对反向排列、长度适中的重复序列间的基因组节段而非重复序列本身进行PCR扩增。ISSR标记通常为显性标记，扩增反应所用的两翼引物中，可以是ISSR引物或是随机引物[23]；如果一个是ISSR引物，另一个是随机引物，则又称为随机扩增微卫星多态性（Random amplified microsatellite polymorphisms，RAMP）[21]。基于 SSR 寡核苷酸直接作为引物来扩增基因组DNA的多位点方法，在实验过程中可由SSR重复单元序列的改变、引物长度不同以及5'和3'末端锚定核苷酸的有无产生扩增模式的不同[21]。扩增产物可以是SSR之间的序列或是SSR之间的序列加上SSR序列，这依赖于不同引物的使用。典型的每个反应每个泳道产生20多条条带[5]，依赖于不同的物种和引物。ISSR技术在同一块凝胶中可揭示多基因位点的信息，产生用于多样性分析和基因图谱的多态位点标记，该技术提供了一种新的DNA指纹研究方法，可用于分类学与种系发生学的比较以及品种鉴定和种群遗传学研究，也可作为遗传连锁图谱构建的工具广泛应用于生物学领域。

2 ISSR分子标记技术的应用

ISSR技术由于引物较长，退火温度较高，这就增强了实验的可重复性[6,30]，同时操作简单、快速、高效，不需要繁琐的构建文库、设计引物、杂交、同位素显示等步骤，而且ISSR标记可以揭示整个基因组的一些特征，并成孟德尔式遗传[5,7]，因此该技术一问世就在植物遗传分析中得到广泛应用。ISSR标记一般是显性遗传[5,7]，在谱带统计和遗传分析中需引起注意。

2.1 遗传多样性分析

由于ISSR技术能提供较大数目的DNA片段，可以扫描基因组内的多态位点，它在生物学中最主要的应用就是分析和评估物种、种群、不同品系、甚至是不同种群的遗传多样性[24]。余贤美等采用ISSR标记技术对海南、云南、广西3省的12个杧果野生居群共265个个体的遗传多样性水平及居群遗传结构进行研究[25]，其中广西的3个居群(那坡、邕宁、平南)优先与云南的文山居群聚为一支；而云南的永德和版纳居群各自聚为一支。Sagar等利用ISSR技术对70个品种的芒果进行遗传多态性分析，结果发现ISSR技术作为检测遗传多样性是行之有效的方法[26]。何显静等对分布于云南境内的紫斑百合（Lilium nepalense）3个居群进行了ISSR分子标记分析，平均有17.85%的遗传变异来自于居群内，82.15%的遗传变异来自于个体间，表明居群内存在巨大的遗传变异，个体杂合程度较高，适应力强[27]。杨若林等用筛选到的12个ISSR引物对我国11个辣椒农家品种进行扩增，结果共扩增出66条谱带，其中差异条带26条，多态条带比率为39.39%；品种特异条带7条，占总条带数的10.61%[8]。基于Jaccard遗传相似性系数的Neighbor Joining聚类分析可以将11个辣椒品种分为两组，每组所含辣椒品种与聚类分析的结果相同。Talhinhas等应用AFLP，ISSR和RAPD分子标记技术分析羽扇豆（Lupinus polyphyllus）种间和种内的遗传多样性，结果检测到57.00%～78.00%的不相似性，适于研究植物种间遗传多样性，表明分子标记技术有助于美国羽扇豆的分类和亲缘关系的鉴定[28]。

2.2 品种和种质鉴定

ISSR分子标记技术的快速发展，为品种和种质资源的快速鉴定提供了可能，成功的解决了有效管理、利用物种资源以及对种质的准确鉴定和评估问题。Prevost等仅用4个ISSR引物就可产生大量的多态性条带，其中两个最富信息量的引物均能将34个番茄栽培品种区分开，任意两个引物复合使用均能鉴别所有的栽培品种[29]。Charters等也发现所测试的4个5′端锚定的ISSR引物均能够区分20个芸苔和芫菁栽培品种中的16个品种，任意两个引物的复合使用就能区分所有的20个栽培品种[30]。也有报道表明通过ISSR标记还可区分仅能通过水果品质加以鉴别柑桔的栽培品种[32]，另外，Wolfe等用居群取样方法在玄参科吊钟柳属Pen stemon杂种复合体中得到了10～24个种专一的ISSR标记，清楚地支持了物种P.clevelandi的二倍体杂种起源[31]。

2.3 物种和种群亲缘关系研究

ISSR技术也用于种群内、种群间和物种间的研究。Tsumura等采用ISSR方法研究了日本雪松（Cryptomeria japonica）和花旗松（Pseudotsuga menziesii）之间的亲缘关系[32]。结果表明，24个ISSR引物有87%～100%左右在这些物种中为多态性引物，但物种间的多样性无差异；同时还发现，海岸边的花旗松变种比内陆变种的杂合性高。Fang等用10个SSR引物分析了柑橘35个种之间的亲缘关系，可将这35个种分为5个类群，由ISSR标记所得到的分类结果和前人一致[33]。Gulsen等研究表明枸椽对柠檬基因组形成有相当大的贡献[34]。Isshiki等对20个茄子品种进行遗传多样性分析，从100对引物中筛选出34个引物用于茄子的ISSR-PCR，扩增出552个多态性位点，利用这34个引物可以充分的确定茄子的亲缘关系[10]。Eiadthong等对13个泰国芒果品种的ISSR分析表明，其中2个品种与其他品种关系较远，而另外11个品种可分为3个类群[35]。Lanham等对醋栗的ISSR分析表明，醋栗次级基因库遗传变异丰富，可运用于早期育种计划[36]。树状图更忠实地反映了大麦栽培品种间的系统关系。Dávila等用RAMP技术来研究欧洲大麦亚种间的遗传关系，根据56个ISSR多态性片段，计算亚种间的遗传距离[37]。结果发现，冬季栽培品种和大麦样品（Hordeum vulgare ssp.Spontaneum）间的遗传距离最小；另外，Huang等用ISSR和4个叶绿体DNA非编码区的限制性位点变异来研究40个甘薯属（Ipomoea）样品的遗传多样性和种内关系[38]。对比ISSR技术与核基因DNA限制性分析对甘薯属样品的检测结果表明，ISSR技术可检测到甘薯属样本中较多的遗传变异。

2.4 遗传图谱的构建

遗传图谱（Genetic map）是指以染色体重组交换率为相对长度单位，以遗传标记为主体构成的染色体线状连锁图谱。通过构建遗传图谱可为基因定位与克隆及基因组结构和功能的研究打下基础。传统的遗传标记技术标记数目少，难以形成较完整的连锁图。目前已构建了番茄、马铃薯、辣椒、莴苣、甘蓝、胡萝卜、芥菜、豌豆、黄瓜、白菜、芹菜等约20种蔬菜作物遗传图谱，其中番茄、马铃薯、甘蓝等的图谱已趋于饱和。张仁兵等用西瓜的重组自交系构建了遗传图谱，此图谱包括87个RAPD标记，13个ISSR标记和4个SCAR标记，15个连锁群[39]。姜帆等以立冬本龙眼DNA为模板研究了龙眼ISSR-PCR反应体系的主要成分对ISSR扩增结果的影响，并探讨了构建龙眼指纹图谱的可行性，利用丰富的多态性DNA谱带构建了12个基因型龙眼的指纹图谱[40]。刘威生等在优化的反应条件下建立了5个种12份杏材料的ISSR指纹图谱[41]。

2.5 基因定位

在蔬菜作物中，许多重要的农艺性状均表现为质量性状遗传，如抗病性、育性等，可利用分子标记进行质量性状目标基因定位。吴旭红利用ISSR标记技术获得了一个与甜菜抗病基因紧密连锁的ISSR标记ISSR0061，在F2群体分离中符合1∶3的分离比例，有关ISSR标记BA0061-1200抗性基因连锁的紧密程度还有待今后对F2分离群体进行个体寄主植株的抗病性鉴定和ISSR对应分析研究[42]。吴旭红用BSA法和ISSR技术对155个随机引物进行筛选，获得了一个与甜菜根腐病基因紧密连锁的ISSR标记OPP0760，可以用作抗根腐病基因的选择依据[43]。

2.6 辅助选择育种

在育种实践中借助分子标记对目标性状的基因型进行选择称为标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）。目前在黄瓜分子图谱中发现有较多紧密连锁的位点，特别是一些形态学基因（F、dm、B、CcU、11）与一些分子标记间存在较紧密的连锁，可实施标记辅助选择。Serquen等的研究表明，标记辅助选择用于主茎长和多侧枝形状的选择是有效的[44]。Yu等找到了与抗大豆花叶病毒基因（Rsv）紧密连锁的SSR标记，遗传距离仅为0.15 cM[45]。可见，通过分子标记辅助选育可以大大提高育种的选择效率，为开展作物品种资源鉴定和遗传改良提供了一种快捷手段。

3 ISSR分子标记的展望

ISSR分子标记技术诞生只有短短几十年，却得到了广泛应用，为园艺作物研究开辟了新途径，更为园艺作物种质资源和品种的鉴定、分类、遗传图谱构建及目标性状基因标记等提供了理想方法。因其引物容易设计、实验重复性强、操作过程简单、不须使用同位素的特点，可以揭示更高程度的DNA多态性。因此，ISSR标记在园艺作物研究中具有广阔的应用前景和巨大潜力。但任何一种分子标记都不能解决所有问题，在今后的研究工作中，应根据不同的研究需要，选择合适的分子标记，或将不同的标记结合起来进行综合研究，以提高分子标记的选择效率。

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