有机污染物的微生物修复研究进展

王文飞，刘铭瑶，李德山

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

有机物污染由于其残留期长、生物蓄积度高及对生物体危害性大而备受关注[1]。目前对有机污染物的处理方法主要有填埋法、工程治理法和生物处理法。其中，填埋法由于难以阻止有机污染物在土壤环境中的迁移扩散以及对地下水的进一步污染，目前已经被摒弃；工程治理法由于其投资大、占地多又需特殊设备，同时会产生二级垃圾，也不是最佳的处理方法。与上两种方法相比，生物处理法主要利用天然生物（以微生物为主），利用生物体本身作为催化剂来降解环境中有机污染物。目前生物处理主要利用从被污染场地中筛选出可利用的菌株对污染物进行处理，由于菌株活力不够，该方法存在其降解效果不佳，出水COD浓度偏高，难以达到国家排放标准等问题，不能完全取代填埋及工程治理法。随着近几年分子生物学及微生物学的发展，科研人员通过基因组学、酶学等手段对降解微生物代谢有机污染物的机制有了更深的了解，本文总结了典型的有机污染物的生物修复途径研究进展[2-6]，为研究人员通过基因工程等技术进行污染物治理菌种的改良提供理论依据。

1 微生物修复

微生物对有机污染物的生物修复主要通过两种方式来完成，一种是生长代谢的方式，另一种是通过微生物的活动改变化学或物理环境而间接作用于有机污染物的方式。能够进行生长代谢生物修复的微生物本身含降解该有机物的酶系基因，或本身虽无该酶系基因，但是经诱导或环境存在选择压力，基因发生重组或改变产生了新的降解酶系，能以有机污染物为碳源和能源物质进行分解和利用。具有第二种代谢方式的微生物又分为以下3种：①矿化作用：微生物直接以有机污染物作为生长基质，将其完全分解成无机物；②共代谢作用：共代谢型微生物不能利用有机污染物作为碳源和能源，须从其它底物中获取大部分或全部的碳源和能源，共代谢基质选择和代谢酶的诱导是控制目标污染物降解的关键因素，高浓度有机污染物对共代谢微生物存在明显的抑制作用；③种间协同代谢：同一环境中的几种微生物联合代谢某种有机污染物。目前对于微生物生物修复研究的核心问题是关键酶的诱导及其活性的维持、生长机制与目标污染物之间的竞争抑制、目标污染物及其中间降解产物对微生物毒性作用[7-8]。

2 有机污染物的生物修复途径

2.1 芳香烃族化合物的生物修复途径

有机物、石油、汽油等产品的不完全燃烧和各类工业活动都会导致芳香烃族化合物特别是多环芳香烃（PAHs）的产生[9-12]，这类物质对自然界的危害极大且利用传统方法很难消除该类物质。近年来的研究结果显示，自然界中多种细菌、真菌和藻类等微生物可以用于PAHs的清除[13]。

Sims等研究发现，PAHs修复的第一步反应是由双加氧酶/单加氧酶参与下的氧化芳香环步骤，此后再经过加氢、脱水等作用使C-C键断裂，减少苯环数，最后将污染物降解为TCA循环过程中的中间代谢产物[14]。真菌中含有的单加氧酶可加一个氧原子到苯环上形成环氧化物，加入H2O产生反式二醇和酚。细菌体内的双加氧酶可加两个氧原子到苯环上，氧化为顺式二醇，脱氢产生酚，最终将底物降解成三羧酸循环过程中的中间关键代谢产物，进入循环氧化，近年来的研究结果显示这一过程还伴随着脱氮和硫的还原反应[15-16]。

对单环芳香烃苯的降解主要是利用苯双加氧酶攻击苯环，形成邻苯二酚，邻苯二酚进一步通过间位或邻位双加氧酶的作用而产生粘康酸半醛或粘康酸，之后代谢产物被进一步降解。对于侧链很长的烷基取代苯，微生物不会降解苯环；而对于侧链较短的烷基取代苯，一般是使得苯环的2，3位羟化，形成不稳定的邻苯二酚类物质，最后开环降解。

已有研究表明，克隆编码甲苯还原酶的基因todC1C2BA，并将重组质粒导入P.putida mt-2中，可彻底降解苯、甲苯和二甲苯[17]等单环芳香烃。吴坚阳等从农药厂二沉池污泥中筛选分离得到两株革兰氏阴性的芳香烃降解菌ZD4-1和ZD4-3，利用紫外光谱扫描和双加氧酶对产物的检测发现，菌株ZD4-1利用邻裂途径降解苯酚，而ZD4-3则通过间裂途径降解苯酚，邻裂途径的1，2双加氧酶和间裂途径的2，3双加氧酶都是可诱导的双加氧酶，其活性强烈的依赖于降解底物的出现[18]。刘和从农药厂活性污泥和煤气厂污水排放口处的土壤中分离到三株降解能力较好的芳香烃降解菌，分别属于多食鞘氨醇杆菌，睾丸酮丛毛单胞菌和铜绿假单胞菌[19]。其中有关多食鞘氨醇杆菌对五氯酚（PCP）的共代谢降解的研究结果表明，以葡萄糖为生长底物比以苯酚为生长底物时PCP降解效果更好，当葡萄糖的量能够满足细菌的生长，提供降解PCP所需的还原性物质的量时，则生长底物不再是PCP降解的限制性因素。

2.2 环硝胺类物质（RDX、HMX和CL-20）的生物修复途径

环硝胺类物质是军用火药，也是一种被广泛用于化学工业和印染工业中的原料，该物质的大量使用对环境造成严重的污染。目前已发现多种好氧细菌、厌氧细菌和真菌等可以转化RDX、HMX和CL-20，通过微生物的代谢来降低其对自然界的危害[20]。

Hawari认为硝基还原酶可以催化cL-20首先形成阴离子自由基，使其处于一种易脱硝基的不稳定状态，进而发生开环，生成的中间产物在水溶液中可被分解生成NH4+、N2O、HCOOH和乙二醛[21]。Bhushan等报道了来源于厌氧菌Clostridium kluyveri的心肌黄酶（EC.1.8.1.4）催化RDX的反应，发现RDX在心肌黄酶的作用下，以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）为氢供体，首先生成阴离子自由基，即为初级反应；随后RDX自由基发生脱氮反应，导致开环，最终水解生成N2O、NH4+、HCHO和NO[22]。第二年，Bhushan又利用黄嘌呤氧化酶催化HMX[23]，发现这种酶在厌氧条件下的催化速度优于在有氧条件下的催化速度。在还原的过程中，HMX最终被分解产生亚硝酸盐、亚甲基二硝基胺、甲醛、一氧化二氮和甲酸和铵盐。

2.3 烷烃的生物修复途径

对烷烃类物质污染的研究历史已久。陆健等从原油中分离筛选到一株可高效降解烷烃类物质的细菌（铜绿假单胞菌，XCZ），XCZ以正十八烷为唯一碳源进行复制增值[24]。研究表明，在以浓度为500 mg·L-1正十八烷为唯一碳源的培养基中，持续培养XCZ 40 h后正十八烷降解率高达97.5%，同时XCZ还可有效降解高浓度原油中C_（13）-C_（32）的直链烷烃，对 C_（13）-C_（24）烷的降解率大于80%。张璐等从原油污染土壤中分离的一株石油烃降解菌15-3（红球菌）也可利用正十八烷为唯一碳源进行生长，且该菌株在低温（10℃）及高盐（4%～5%NaCl）等恶劣环境下也具备良好的降解烷烃能力，对C_13～C_32的正构烷烃、芳香烃及姥鲛烷都有一定的降解能力[25]。

2.4 多氯联苯（PCBs）类物质的生物修复途径

PCBs是加工绝缘油、阻燃剂、导热剂、液压油、增塑剂等材料的主要原料。由于具有极强的脂溶性，PCBs能够轻易地进入自然界的食物链，从而在生物体内蓄积进而危害人类健康。研究表明以自然界中多种微生物都具备降解PCBs等能力。Seeger、Arsendorf、Abramowicz等研究认为，对于氯取代位点集中在一个苯环上的氯代联苯，其降解途径是在2，3双加氧酶的作用下生成氯代苯甲酸和4-羟基戊酸，生成的4-羟基戊酸可被降解菌株彻底矿化，而另一个产物氯代苯甲酸需被其他微生物进一步降解[26-27]。由于自然界中的PCBs降解菌株的修复效率比较低，无法满足治理污染的要求。科研人员目前已经在通过重组DNA的方法获得高效的工程菌以满足需要。Brenner等利用2，3-双加氧酶途径的关键酶基因和宽宿主范围的质粒构建了重组工程菌株，含有上述降解酶基因的大肠杆菌可以直接利用PCBs，而且不需要联苯诱导，从而大大加快了PCBs的修复速度[28]。

2.5 氯乙烯类污染物的生物修复途径

氯乙烯类化合物中常见的是三氯乙烯（TEC），是地下水和土壤中的主要污染物。近年来，大量研究证实氯化物可通过共代谢好氧途径降解。Michael等从被四氯乙烯污染的土壤中分离出大量对四氯乙烯及其潜在的降解产物具有修复能力的菌株，并在人工条件下进行驯化和增殖，通过鼓气和水流循环的办法控制地下微生物的生存环境，进而修复四氯乙烯污染[29]。检测回流水获得的数据显示，采用改技术手段后，不到1个月的时间内水中的四氯乙烯的浓度从470 pg·L-1下降到3.5 pg·L-1，四氯乙烯降解的中间产物三氯乙烯、二氯乙烯和一氯乙烯的浓度也在显著下降，污染物的总去除率在90%～99%。

2.6 硝基化合物的生物修复途径

常见的污染物包括三硝基苯甲硝胺（Tetryl）、梯恩梯（TNT）[30-31]。心肌黄酶是目前公认一种可有效修复由硝基化合物造成的污染的蛋白酶。心肌黄酶是一种黄素蛋白酶，它的功能是制止醌类自由基和醌类自由基引发的超氧阴离子（O-2）的生成[32]。该蛋白酶不仅对一些染料既有降解的特性[33]，还能够高效地对硝基物进行催化还原反应。心肌黄酶的还原过程是一种单电子传递过程[34]。一氧化碳脱氢酶（CODH）在饱和CO条件下，催化TNT转化成2种单羟胺衍生物（2HA46DNT和4HA26DNT），这些衍生物之后转化为24DHANT，后者会慢慢转化成Bamberger重排产物，从而达到对TNT的降解作用。Shah和Spain报道了一种对氧敏感的硝基还原酶—铁氧化还原蛋白NADP氧化还原酶[35]，首先转移1个电子，使三硝基苯甲硝胺生成阴离子自由基，加氢使之脱去硝基，生成亚硝酸盐，达到修复污染的目的。

3 结论

难降解性有机污染物，如多芳香烃（PAHs）、环硝胺类物质（RDX、HMX、Tetryl和CL-20）、多氯联苯（PCBs）、烷烃类化合物、氯乙烯类、硝基化合物（TNT）等物质排放量的日益增多，由于传统方法无法有效去除该类物质引起的污染，因此研究更加清洁的方法来解决难降解性有机污染物迫在眉睫，而微生物的生物修复方法因其清洁、环保、不造成二次污染等优点，成为目前国内外研究的热点。目前的生物修复所选用的微生物菌株主要为污染场地筛选出的菌株为主，由于野生菌株处理难降解有机物时修复效率较低，而且分解氧化此类污染水中所含苯酚、氯苯胺及DDT等有机物的微生物的世代期较长，难以在常规的生物处理构建物中大量存留，因此生物修复在有机污染物的处理上还没有形成规模。

除传统的诱变菌种外，随着现代分子生物学技术（核酸探针技术、荧光原位杂交、基因重组及基因芯片技术等）在环境微生物中的进一步应用，对微生物生物修复途径及机理有了深层次了解。明确化合物的降解途径和生物降解规律，在此基础上构建能够高效降解多种污染物的重组菌株，是开发新的生物降解技术、培养和驯化适宜的生物种群和生物酶、以及研究有机污染物生物降解的必然选择。

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