粘液与非粘液型鲍曼不动杆菌诱导肺腺癌细胞产生IL-8的研究

李宏 李伟 王星冀 张金艳 郭秀娟 李丽 魏媛媛

研究表明，从细菌黏附定居、生长扩散到宿主的生理失衡，均与不同种类的细胞因子有关［1］。本文对两种菌落形态的鲍曼不动杆菌的活菌菌悬液、培养上清液及菌体裂解液诱导人肺腺癌细胞表达白介素-8(IL-8)的能力进行研究。目的在于初步探讨鲍曼不动杆菌引起肺癌细胞感染的机制，该菌是否能直接诱导人肺腺癌细胞表达IL-8从而引发炎性反应，以及两种表型的鲍曼不动杆菌刺激细胞表达IL-8的能力是否有差别。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞来源 鲍曼不动杆菌本室分离保存，A549细胞购自协和医科大学基础医学院细胞中心。

1.2 主要试剂 PRMI-1640，Gibco公司。胎牛血清，杭州四季青生物制品研究所。哥伦比亚琼脂，法国生物梅里埃公司。Trizol，Invitrogen公司。RT试剂盒，Fermenters公司。PCR试剂盒，Promege公司。琼脂糖，REGULAR公司。DNA marker，Fermenters公司。

1.3 仪器 低温离心机20B型，日本HITACHISCR。7300 PCR扩增仪，美国ABI。DF-CⅡ型水平电泳槽，北京东方。凝胶成像仪，美国FOTODYNE公司。

1.4 主要方法

1.4.1 活菌悬液制备:收集平板上过夜的细菌，将其悬于无双抗无血清的RPMI-1640中并混匀，制备2×109cfu/ml的菌悬液，并依次稀释10倍、100倍，使其终浓度为2×108cfu/ml、2×107cfu/ml。

1.4.2 菌体裂解液制备:分别将3个浓度的活菌悬液20 ml在冰浴下超声(频率为5 000 Hz)30 min，过滤除菌。

1.4.3 耗尽上清液的制备:250 ml的LB培养基中加入2×109cfu/ml的菌悬液2 ml，150 r/min震荡培养72 h，离心取上清并过滤除菌。

1.4.4 细胞培养:肺腺癌细胞 A549，37℃，5%CO2培养箱孵育，培养基为含10%胎牛血清，100 μg/L的链霉素和100 U/ml的青霉素，RPMI-1640。待其在25 cm2的培养瓶中长至单层(约2×106)，弃去培养基，用D-hank’液冲洗三遍，向其中加入2 ×109cfu/ml、2 ×108cfu/ml、2 ×107cfu/ml的菌悬液、菌体裂解液及培养上清液3 ml，与细胞共同孵育6、12、24 h。

1.4.5 人肺腺癌细胞总RNA的提取:细胞用D-hank’冲洗三遍。加入Trizol 1 ml，充分吹打后，将其移到无RNA酶的EP管中，于冰上静置10 min。加入氯仿0.2 ml，加盖，用力震荡12 s后，冰上静置5 min。4℃，10 800 r/min离心15 min。吸取上层水相，转移至另一无RNA酶的EP管中。在EP管中加入等量的异丙醇，加盖，上下颠倒混匀，冰上静置10 min，形成RNA沉淀。同上离心10 min，弃上清。加入0.4 ml 75%乙醇充分洗涤沉淀，4℃，8 550 r/min离心5 min，弃上清，将 RNA沉淀溶于40 μl无RNA酶的蒸馏水中。采用紫外分光光度计测定RNA浓度，使 A260/A280 比值在1.8 ～2.0，并稀释至1 μg/μl，于4 h内进行cDNA的合成。

1.4.6 cDNA的合成(逆转录):0.5 ml无 RNA 酶的微量离心管内加入总 RNA 6 μl，oligo(dT)1 μl，DEPC 水 5 μl，于 70℃ 预热5 min，迅速置冰上，离心数秒。加入5 × buffer 4 μl、dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl、RNAnasin(20 U/μl)1 μl。37℃预热5 min，迅速置冰上。再向微量离心管内加入MMLV 1 μl。42℃恒温60 min，进行逆转录反应，70℃加热10 min，灭活逆转录酶活性。

1.4.7 引物的合成:IL-8引物序列参考文献［1］，上海生工生物工程公司合成。引物序列如下:

IL-8 5’-CGATGTCAGTGCATAAAGACA-3’ 200

5’-TGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAA-3＇β-actin 5’-AAATCGTGcGTGACATTAA-3＇ 472

5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3

1.4.8 PCR 扩增:0.5 ml微量离心管内加入 2 ×GoTaq Green Master Mix 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)2.5 μl、下游引物(10 μmol/L)2.5 μl、DNA 模板 2 μl、双蒸水 5.5 μl。反应条件为:94℃ 10 min，94℃ 1 min，53℃ 45s，72℃ 80 s，30 cycles，72℃10 min。内参(β-actin)95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 45 s，72℃60 s，40 cycles，72℃ 10 min。

1.4.9 PCR产物定量分析:将扩增产物4 μl上样于1%琼脂糖凝胶，1×TBE缓冲液，电压80 V/cm。分析电泳结果，以待测细胞因子的光密度对同一标本内参(β-actin)光密度的比值表示该细胞因子mRNA的表达水平。

1.5 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2种鲍曼不动杆菌活菌菌悬液及培养上清液与肺腺癌细胞IL-8表达比较 孵育后均只在24 h时间点表达IL-8;粘液型的菌体裂解液在2×108cfu/ml时可以诱导人肺腺癌细胞表达IL-8，而在2×109cfu/ml、2×107cfu/ml时均不能诱导人肺腺癌细胞表达IL-8;非粘液型的菌体裂解液在各浓度则均不能诱导人肺腺癌细胞表达IL-8。见表1。

2.2 粘液型与非粘液型的活菌悬液诱导肺腺癌细胞表达 粘液型在2×108cfu/ml时最强，且差异有统计学意义(P＜0.01);非粘液型的活菌菌悬液诱导肺腺癌细胞表达IL-8的能力随着浓度的降低而增强，且差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

2.3 粘液型和非粘液型的菌液比较 2×108cfu/ml粘液型的活菌菌悬液较非粘液型的诱导表达IL-8能力强，培养上清液均较非粘液型的诱导表达 IL-8能力弱，且差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

2.4 菌悬液与裂液比较 2×108cfu/ml的粘液表型的活菌菌悬液较菌体裂解液表达 IL-8能力强，且具差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1粘液与非粘液鲍曼不动杆菌IL-8的表达情况±s

表1粘液与非粘液鲍曼不动杆菌IL-8的表达情况±s

注:与2 ×109菌悬液比较，*P ＜0.01;与2 ×108菌悬液比较，#P ＜0.01;与2×108菌悬液比较，△P ＜0.01

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3 讨论

细胞因子通常是一组可溶性多肽、蛋白质或糖蛋白，对细胞、组织和机体功能起调控作用。目前，主要将它划分为六类，分别是白介素、细胞毒细胞因子、干扰素、集落刺激因子、生长因子、趋化因子。IL-8作为一种趋化因子，是一种强效的中性粒细胞趋化物质，可将白细胞吸引到损伤、炎症和感染部位。IL-8具有显著的PMN趋化作用特异性，可在肺部积聚;IL-8释放的增加是导致肺部感染中性粒细胞(PMNS)聚集最主要的原因［2，3］。

2种菌落的鲍曼不动杆菌活菌菌悬液及培养上清液与肺腺癌细胞孵育后均只在24 h时间点表达IL-8;粘液型的菌体裂解液在2×108cfu/ml时可以诱导人肺腺癌细胞表达IL-8，而在2×109cfu/ml、2×107cfu/ml时均不能诱导人肺腺癌细胞表达IL-8;非粘液表型的菌体裂解液在各浓度则均不能诱导人肺腺癌细胞表达IL-8。说明两种菌落的鲍曼不动杆菌活菌、分泌因子均可以吸引中性粒细胞的集聚诱发或加重感染;粘液型鲍曼不动杆菌的菌体成分仅在2×108cfu/ml这个合适的浓度时才有可能参与该过程，非粘液型的鲍曼不动杆菌的菌体成分则可能不参与该过程。

本研究粘液型菌悬液在高浓度2×109cfu/ml时刺激肺腺癌细胞表达细胞因子IL-8，与非粘液型差异无统计学意义(P＞0.05)，说明菌悬液浓度高时，不同型的菌株均可吸引大量中性粒细胞集聚造成损伤。

3个浓度为的两种菌落形态的鲍曼不动杆菌活菌菌悬液均能诱导人肺腺癌细IL-8的表达，IL-8随着菌悬液、菌体裂解液浓度的降低呈增强趋势。说明鲍曼不动杆菌虽然可以诱导人肺腺癌细胞表达，但浓度过高的菌悬液中细菌(或菌体成分)较多，导致细胞最大程度的破碎，那么细胞表达的IL-8量也就较少。

粘液表型鲍曼不动杆菌的菌体裂解液在2×108cfu/ml可诱导人肺腺癌细胞 IL-8的表达，在 2×108cfu/ml、2×107cfu/ml浓度时不能诱导人肺腺癌细胞IL-8的表达。可见IL-8的表达并非与菌体裂解液的浓度成正相关，而是存在一个最适浓度。

粘液表型的耗尽上清液(SCS)较非粘液表型的SCS诱导人肺腺癌细胞表达IL-8强，说明粘液表型的鲍曼不动杆菌在代谢过程中可以产生较非粘液表型的鲍曼不动杆菌更多的有生物活性的可溶性产物，其分泌因子的性质和数量尚待进一步探讨。

3个浓度鲍曼不动杆菌菌悬液较同浓度菌体裂解液诱导人肺腺癌细胞表达IL-8的能力强，说明鲍曼不动杆菌诱导人肺腺癌细胞表达IL-8主要不是通过细菌或菌体成分与细胞膜受体分子的相互作用，而更加依赖于活菌对上皮细胞的侵袭，进入到细胞内，激活胞内受体而起刺激作用。

1 Beck GC，Rafat N，Brinkkoetter P，et al.Hetero Geneity in lipoplysaccharide responsiveness of endothelial cells identified by Gene expression profiling:role of transcription factors.Clinical and Experimental Immunology，2006，143:523-533.

2 Luppi F，Longo AM，de Boer WI，et al.Interleukin-8 stimulates cell prolifertion in non-samll cell lung cancer through epidermal growth facter receptor transactivation.Lung Cancer，2007，56:25-33.

3 Araki S，Omori Y，Lyn D，et al.Interleukin-8 is a molecular determinant of androgen independence and progress in prostate cancer.Cancer Res，2007，67:6854-6862.