固体基质室温磷光法测定痕量卡维地洛

林常青，孙莉娜，林 洵



固体基质室温磷光法测定痕量卡维地洛

林常青，孙莉娜，林 洵

（漳州职业技术学院 食品与生物工程系, 福建 漳州 363000）

提出一种简便、灵敏、选择测定卡维地洛（CV）的固体基质室温磷光法（SS-RTP）。所发展的方法是基于十二烷基苯磺酸钠（SDBS）增敏CV活化NaClO氧化苋菜红（A）反应而导致体系的室温磷光（RTP）的剧烈猝灭。与无SDBS时比较，体系的磷光增强度(Δp)增大17.5倍，并且CV含量在0.200-40.0 pg/mL范围内与Δp值成线性关系，相关系数（r）为0.9976，检出限为5.1 × 10−14 g/mL(取样量为0.40 μL），具有很高的灵敏度。此外，此灵敏的方法用于测定人血清中残留CV含量的测定，结果与同步荧光法.相吻合。该反应的活化能(E)与速率常数()为69.04 Kj/mol 与 3.580×10−4/s。

卡维地洛；苋菜红；增敏；活化；固体基质室温磷光法

1 引言

卡维地洛（CV）是一种非选择性β受体阻滞剂，用于抗心绞痛的高血压药物，并也可用于充血性心力衰竭的治疗。与此同时，CV被世界反兴奋剂机构和国际奥林匹克委员会列为违禁药物之一。因此，研究CV含量的测定方法对人体疾病的预警与防治以及反兴奋剂的体育运动具有重要意义和应用前景。

当前用于测定生物试样如血浆，血清，尿液中的CV的方法有液相色谱-质谱-质谱法 (LD= 0.20 ng /mL)[1]，液相色谱荧光法 (LD = 1.56 ng/mL)[2]，高效液相色谱电化学法 (LD = 0.10 ng/mL)[3]，气相色谱-质谱法 (LD = 0.30 ng/mL)[4]和 LC-LC-荧光检测耦合法 (LD = 0.70 ng/mL)[5]。但是，这些方法有诸多局限，比如耗时、样品处理过程繁琐毒性大、灵敏度低、测定时间长、仪器昂贵、不利推广利用等。有些化学家虽然建立了简便的方法，如高灵敏的流动注射荧光光谱法(LD = 3.63 × 10−9mol/L)[6]和化学发光法 (LD = 8.7 × 10−9mol/L)[7]，但其背景的干扰大，选择性较差，且推广应用有一定的局限性；上述方法的灵敏度仅达ng级，不能满足pg级CV 测定的需求。因此探索高灵敏、高选择性、简便、快速测定CV含量的新方法具有重要的学术研究价值。

室温磷光(RTP)作为一种检测手段具有Stokes' 位移大、易于减少或消除本底荧光和散射干扰、发光寿命长等优良特性。基于RTP的变化，建立的催化SS-RTP (LD = 5.2×10−20g/mL宝泰松)[8]、抑制SS-RTP (LD = 6.5×10−12g/mL托布他林)[9]、SSRTP传感器[10]、磷光开关SSRTP[11]、曙红Y分子自组装SSRTP[12]和离子印记SSRTP[13]、离子缔合SSRTP[14]及固体基质室温磷光免疫法[15]等，充分显示了SS-RTP用量少，操作简便灵活、高灵敏、高选择性等独特优点。其中，催化SS-RTP、分子自组装SSRTP、固体基质室温磷光免疫法和离子缔合SSRTP是分别借助催化反应的信号放大效应、曙红Y分子自组装、二溴荧光素纳米微球及增加配位体发光分子数目等途径，以增加生物靶上的RTP信号，从而提高SSRTP的灵敏度。采用其它途径进一步提高SSRTP的灵敏度是当今SSRTP的研究热点。

本研究的目的是开发一种简单、快速、选择性和灵敏度好的测定CV的SS-RTP。在深入探讨检测兴奋剂新方法的实验中，我们在硝酸纤维素膜（NCM）上不仅观察到苋菜红(A)能发射稳定的RTP，而且发现A能被NaClO氧化而发生RTP猝灭，CV被NaClO氧化而生成氯胺，生成的氯胺与A发生反应，使A被进一步氧化，显示CV对NaClO氧化A反应有强的活化作用。更有意义的是十二烷基苯磺酸钠(SDBS）可增敏CV活化NaClO氧化A的反应，从而导致RTP信号的剧烈猝灭。与无SDBS时比较，SDBS存在时体系的Δp增大17.5倍，为提高SSRTP的灵敏度提供新的途径。在此实验基础上，我们考察了SDBS增敏CV活化NaClO氧化A的SS-RTP测定CV的可行性、最佳测定条件、分析参数与分析应用。此外，所创建的增敏CV活化SS-RTP及其测定痕量CV的机理鲜见文献报道外，本方法对维护体育赛事的公平性和探讨药物分析的发展具有重要的研究价值和广阔的应用前景。本研究不仅推动SS-RTP与兴奋剂检测技术的研究进展，而且促进体育运动的健康发展。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LS-55型荧光分光光度计及固体前表面处理器（贝克曼有限公司, 美国）；AE240型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；pHS-3B酸度计；80-2 离心机（上海手术器械厂）；0.5µL平头微量注射器（上海医用激光仪器厂）。

CV工作溶液：称取0.00500 g CV标准品(Sigma), 用1mL of 4.0% (m/v) 乙醇溶液溶解，并定容至50.0 mL。此标准贮备溶液的浓度为0.10 mg/mL。临用时, 用水溶液稀释成100.00 fg/mL，避光存放。1.00×10−2mol/LA的水溶液: 0.6045 g用水溶解，并定容到100 mL, 临用时逐级稀释。NaClO溶液的配制：10% NaClO临用时逐级稀释制得。SDBS溶液: 称取3.00gSDBS, 用水溶液溶解，并定容至100.0 mL，临用时逐级稀释制得所需浓度。Britton-Robinson缓冲溶液（pH 11.2）﹕在100 ml三酸混合液（磷酸、乙酸、硼酸，浓度均为0.040 mol/L）中，加入85.0ml的0.2mol/LNaOH，混合均匀即得。除了CV为基准试剂外，其它为分析纯, 水为三次石英亚沸水。

定量滤纸、聚酰胺素膜（PAM）、醋酸纤维素膜（ACM）与NCM购于杭州新华纸业有限公司。预先剪切成直径为 1.5厘米的圆片备用。

2.2 人血浆样品制备

参考文献[16]方法，10名男性健康志愿者参加受试，年龄(21.5±1.42)岁，身高(170.0±4.85)cm，体重(69.2± 8.13)kg，受试者无心、肝、肾等病史，无低血压史。试验前及试验期间未用任何药物，并禁烟酒。试验期间进统一食谱且低脂饮食。研究方案经医学伦理委员会批准，并签署知情同意书。每名志愿者于早晨(试验前禁食10 h 以上)空腹口服 1 mg CV试剂片（25 mg, 批号为 20090103，宁波市天衡制药有限公司），用250 mL水送服。受试者服药后4h 内保持卧位，服药2 h 后饮水，并在 4h 后进食统一标准午餐。

受试者分别于给药前取空白血样，给药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 由肘静脉各取血5mL，每次取血均应在上述指定时间前后2min内完成。将采集到的血样置肝素化离心管中，离心（3000 r/min）15 min，血浆转移至塑料管中置－20 ℃冰箱保存，一周内测定。

2.3 实验方法

往25 mL比色管中加入适量CV，2.00 mL A，1.50 mL SDBS，2.00 mL B-R，2.00 mLNaClO，水定容，混匀，50℃水浴加热10 min，水流冷却5 min，取NCM（Ф = 15 mm）压痕（Ф= 4.0 mm），浸入1.00 mol/L Pb2+溶液10秒后，于90±1℃干燥2.5 min, 用0.50 µL平头微量注射器悬空点样0.40 µL，90±1 ℃下干燥2.5 min，同时做试剂空白。扫描体系的磷光光谱，记录466 /630(nm)处的p1和p2，计算Δp值。

3 结果与讨论

3.1 磷光光谱

按实验方法扫描SDBS增敏CV活化NaClO氧化A体系的磷光光谱（图1）。结果表明，在B-R缓冲溶液中50℃、10 min 的条件下，虽然Pb2+离子微扰剂能增强A从单线态向三线态跃迁的几率，使A在NCM固体基质上发射RTP（图1曲线5.，λem= 644.7 nm，p= 65.2），但A却被NaClO氧化成为在644.3 nm处不发射RTP的化合物，从而导致A-B-R buffer体系的RTP猝灭（图1曲线6.6'，λem= 644.3 nm，p= 61.4，Δp= 3.8)。当往A-NaClO-B-R buffer体系中加入1000.0 pg CV时，加速体系的RTP猝灭（图1曲线7. λem= 644.6 nm，p= 54.9），显示了CV能活化NaClO氧化A的反应。然而，体系的Δp（6.5）很小，无分析价值。当SDBS存在时，A-NaClO-B-R buffer-CV体系的RTP剧烈猝灭（图1曲线4.，λex/λem= 634.8 nm，p= 171.3），且λemmax蓝移了11.1 nm，可能是SDBS与A作用形成胶束化合物（SDBS-A）。该SDBS- A对CV活化NaClO氧化A的反应有强的增敏效应，导致体系的△p（113.5）比无SDBS时的△p（6.5）增大17.5倍。此实验事实为增敏活化NaClO氧化A的SS-RTP测定CV提供可能性。

图1 SDBS增敏CV活化NaClO氧化A体系的磷光光谱图

3.2 最佳条件

对于CV 20Pg/mL，分别考察试剂的浓度与用量、反应酸度、反应温度和时间、干燥温度和时间、固体基质、增敏剂、离子微扰剂、通氮气时间与放置时间等对体系Δp的影响，结果表明，当选用2.00 mL of 1.0×10−4mol/LA, 2.00 mL of 0.50% NaClO, 1.50 ml of 1.00% SDBS, 2.00 mL of pH 10.88 B-R and 1.00 mol/LPb2+、反应pH为10.88－11.40、反应温度为50 ℃和反应时间为10 min、干燥温度为90 ℃和干燥时间为2.5 min、固体基质为NCM、增敏剂为SDBS、离子微扰剂为Pb2+和通干燥N2时间为10 min时，体系的Δp最大。自取出水流冷却5min 后始计，在5-35 min内体系中的 Δp几乎不变。

3.3 动力学常数

对于CV 20Pg/mL，在30－50 ℃范围内，1/T与– log[logp0/p] 呈正相关，其回归方程为–[p0/p] = −7.284+ 2.682×1000/ T，r = 0.9963，当T = 323 K时，活化能(E)= 69.04 Kj/mol。对于CV 200 Pg/mL，在2―10 min范围内，t与lnp0/p线性相关，其回归方程为p0/p= −0.0259 + 0.0218(min), r = 0.9960，当t = 10 mim时，速率常数(k)= 3.58 × 10−4/s。

3.4 工作曲线、线性范围、检出限

本法CV含量在0.200-40.0 pg/mL (取样量为0.40 μL）范围内与Δp值成线性关系，相关系数（r）为0.9976，对CV 0.25 pg/mL和40.0pg/mL进行8次平行测定,RSD分别为 1.4%、3.7%，检出限5.1 × 10−14g/mL（对试剂空白进行11次测定，求得p平均值为284.8，b为0.045。按3×b/及0.40µL取样量）。

3.5 干扰实验

用本法测定 CV 20.0 pg/mL，当相对误差（Er）为 ± 5 ℅ 时，本法比文献[11, 12]方法的共存离子(物)允许浓度高，选择性好。

3.6 样品分析

各取1.00 mL试液，按实验方法测定血浆样本中的CV含量，显示了血浆中CV的平均浓度与时间的关系：在服用量为78.91 pg/mL水平的CV1.5小时后血浆浓度达到最大值，最低检出浓度为0.80 pg/mL（相对标准偏差（RSD）≤ ± 5%）。测定结果与文献[2]变化趋势相吻合，并且其Er (%) ≤ ± 5%，表明本方法具有高的准确度与精密度。

同时，进行加标回收率实验。由表1可知，本方法的回收率为 96.4%－102 %，RSD 在 1.2－1.6%，测定结果与SF相吻合，表明本方法具有高的准确度，适用于血浆样品中CV的测定。

表1 分析结果(n = 6)

4 结束语

基于SDBS增敏CV活化NaClO氧化A反应而导致体系的室温磷光剧烈猝灭的现象，提出了增敏活化SS-RTP测定CV的新方法及其反应机理。本研究发展了新的SS-RTP与CV残留分析技术，为兴奋剂的检测提供新的方法,为提高SSRTP的灵敏度提供新的途径。同时，为人体疾病的预警与防治提供临床诊断依据，推动体育运动的健康发展。

[1] Eric Yang, Sherry Wang, John Kratz, et.al. Cyronak. Stereoselective analysis of carvedilol in human plasma using HPLC/MS/MS after chiral derivatization [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2004, 36 (4) 609–615.

[2] A. Zarghi, S.M. Foroutan, A. Shafaati, et.al. Quantification of carvedilol in human plasma by liquid chromatography using fluorescence detection: Application in pharmacokinetic studies [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 44 (3) 250–253.

[3] Maiko Machida, Masato Watanabe, Shigeru Takechi, et.al. Measurement of carvedilol in plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection [J]. Journal of Chromatography B, 2003, 798 (5) 187–191.

[4] Seung-Woon Myung, Cheon-Ho Jo. Gas chromatograph–mass spectrometric method for the determination of carvedilol and its metabolites in human urine [J]. Journal of Chromatography B, 2005, 822 (6) 70–77.

[5] Andrei Medvedovici, Florin Albu, Cristina Georgita, et.al. Achiral–chiral LC/LC–FLD coupling for determination of carvedilol in plasma samples for bioequivalence purposes [J]. Journal of Chromatography B, 2007, 850 (7) 327–335.

[6] Rau′ l A. Silva, Chien ChunWang, Liliana P. Ferna′ndez, et.al. Flow injection spectrofluorimetric determination of carvedilol mediated by micelles [J]. Talanta, 2008,76 (8) 166–171.

[7] Cherrine K. Pires, Karine L. Marques, Jo˜ao L.M. Santos, et.al. Chemiluminometric determination of carvedilol in a multi-pumping flow system [J]. Talanta, 2005, 68 (3) 239–244.

[8] Jiaming Liu, Liqing Zeng, Zhiming Li, et.al. Solid substrate-room temperature phosphorimetry for the determination of residual clenbuterol hydrochloride based on the catalysis of sodium periodate oxidizing eosine Y [J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 638 (1) 69–74.

[9] Jia-Ming Liu, Fei Gao, Wen-Yan Gao, et.al. Solid SubstrateRoom Temperature Phosphorimetry for the Determination of Trace Terbutaline Sulfate Based on Its Inhibition Oxidation of Rhodamine 6G by Sodium Periodate [J]. J Fluoresc, 2008, (4) 18:573–579.

[10] Xiaohong Shu, Ying Chen, Hongyan Yuan, et.al. H2O2Sensor based on the room-temperature phosphorescence of nano TiO2/SiO2composite [J]. Anal. Chem., 2007,(10), 3695–3702

[11] Jia-Ming Liu, Fei-Ming Li, Zhen-Bo Liu, et.al. 8-Quinolineboronic acid as a potential phosphorescent molecular switch for the determination of alpha-fetoprotein variant for the prediction of primary hepatocellular carcinoma [J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 663 (7) 184–189.

[12] Jia-Ming Liu, Zhen-Bo Liu, Wen-Qi Li, et.al. Determination of bioactive matter by affinity adsorption solid substrate–room temperature phosphorimetry based on lectin labeled with self-ordered ring of eosin Y [J]. J Fluoresc, 2009 (9) 19:73–83.

[13] Zhi-Ming Li, Jia-Ming Liu, Zhen-Bo Liu, et.al. Preparation for nitrocellulose membrane-poly (vinyl alcohol)-ionic imprinting and its application to determine trace copper by room temperature phosphorimetry [J]. Analytica Chimica Acta, 2007,589 (7) 44–50.

[14] Jia-Ming Liu, Wen-Ting Chen, Qing-Hua Wang, et.al. Determination of trace mercury by solid substrate-room temperature phosphorimetry based on catalytic effect of Hg2+on formation of the ion association complex [Fe(bipy)3]2+·[(FinBr4)2]2-[J]. Talanta, 2004, 62(3)713－717.

[15] Jia-Ming Liu, Guo-Hui Zhu , Zhi-Ming Rao, et.al.Determination of human IgG by solid substrate room temperature phosphorescence immunoassay based on an antibody labeled with nanoparticles containing dibromofluorescein luminescent molecules [J]. Analytica Chiimica Acta, 2005, 528(1) 29-35.

[16] 顾世芬,肖宙, 代宗顺, 等. HPLC-荧光法测定人血浆中卡维地洛浓度及其药动学研究[J]. 中国药科大学学报，2004, 35 (1) :54-56.

Determination of trace carvedilol by solid substrate-room temperature phosphorimetry

LIN Chang-qing, SUN Li-na, LIN Xun

（Department of Food and Biological Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou, 363000, China）

This work proposes a simple and sensitive solid substrate-room temperature phosphorimetry(SS-RTP) for selective determination of carvedilol (CV). The developed method is based on the sensitizing effect of sodium dodecyl benzene sulfonate (SDBS) on CV to activate the oxidation between NaClO and amaranth (A) resulting in the intense quenching of room temperature phosphorescence (RTP) of the system. Compared with non-SDBS system, the reducing value of phosphorescence intensity (Δp) with SDBS is 16.5 times higher and is directly proportional to the content of CV covering a wide range of 0.200－40.0pg mL−1, with a low detection limit (LD) of 5.1×10−14 g mL−1(sample volume: 0.40 μL). Additionally, this sensitive method has been applied to determine trace CV in human plasma, and results were analysed with synchronous fluorimetry (SF). The activation energy () and rate constant () of this activating reaction were 69.04 kJ mol−1and 3.580×10−4s−1.

Carvedilol; Amaranth; Sensitizing; Activating; Solid substrate-room temperature phosphorimetry

2012－09－20

漳州职业技术学院科技资助项目(ZZY1217)

林常青(1963－)，男，福建龙海人，教授。

O629.8

A

1673-1417（2012）04-0013-05

（责任编辑：季平）