多发性骨髓瘤患者骨髓微血管密度和血清β2-微球蛋白检测的临床意义

刘 健，欧阳清，王晓桃，莫东华，唐爱林

(桂林医学院附属医院，广西桂林541001)

多发性骨髓瘤(MM)是B细胞来源的浆细胞恶性血液病肿瘤，其发病机制尚不清楚，目前还不能完全治愈。近年来研究发现，MM的发生、发展依赖于新生的肿瘤血管网，血管新生与MM患者疾病进程及预后密切相关［1，2］。反映血管新生最常用的一项指标是微血管密度(MVD)。目前认为β2-微球蛋白(β2-MG)水平是MM患者最重要的预后因素，是反映体内瘤负荷的一种常用指标［3］。本研究中我们应用免疫组织化学染色检测MM患者治疗前后骨髓MVD，并同时用胶乳增强免疫透射比浊法测定MM患者血清β2-MG，探讨MVD和β2-MG在MM发生、发展中的作用，及其与临床病情和预后的关系，为新诊断MM患者预后的判断及制定新的治疗方案提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年9月～2011年12月在我院初诊并治疗的MM患者34例，其中男21例、女13例，年龄43～78岁、平均56岁。所有MM的诊断与分期均经骨髓细胞形态、X线骨盆或脊柱摄片、生化免疫检查，诊断标准、临床分期及疗效判断均符合《血液病诊断及疗效标准》［4］。按疾病临床分期(ISS)标准:Ⅰ期6例，Ⅱ期8例，Ⅲ期20例。34例初诊患者住院采用T-VAD或BDT、MP方案化疗，4个疗程后进行疗效评估判断。其中缓解组26例，男17例、女9例，年龄43～78岁、平均54岁;未缓解8例，男4例、女4例，年龄47～76岁、平均59岁。另选外周血一系或两系非特异性降低或升高患者的骨髓活检标本作为对照组，共30例，男16例、女14例，年龄21～52岁、平均40岁。均排除恶性肿瘤、血液系统疾病及结缔组织病。骨髓涂片瑞氏染色及骨髓活检苏木精—姬姆莎—酸性品红(HGF)染色证实为正常骨髓象，骨髓活检取材前未应用过糖皮质激素及细胞毒类药物。

1.2 取材与处理 MM患者初诊及4个疗程后，分别行常规消毒髂后上棘局麻后行二步法骨髓抽吸—活检取材，置骨髓活组织于－80℃丙酮液固定，用改良的GMA塑料包埋制成3～5 μm厚的骨髓组织病理切片。同时每例患者清晨空腹采静脉血3 mL测定血清β2-MG。

1.3 免疫组化染色(SP二步法)及血清β2-MG检测方法 免疫组化试剂购自福建迈新生物技术公司。采用CD31作为骨髓血管内皮细胞的标记抗原，一抗为兔抗人CD31单克隆抗体，血管内皮细胞的免疫组织化学染色参照SP超敏试剂盒说明书进行。血清β2-MG测定采用胶乳增强免疫比浊法，使用日本日立公司生产的Roche Modular P800全自动生化及配套试剂。

1.4 骨髓MVD计数 微血管判定和计数方法参照文献［5］，对每张切片进行骨髓MVD计数:低倍镜(100×)视野下选出血管最丰富的3个不相连区域(hot spot)，然后在高倍镜下(400×)计数3个热点(微血管密集区hot spot)的微血管数，取其平均值即为MVD。任何呈棕黄色阳性的内皮细胞或内皮细胞簇，且与邻近血管和骨小梁清楚分开者为1个能够计数的血管，不以是否有管腔或管腔中是否有红细胞为判断标准，排除骨小梁内或与骨小梁相连的血管。巨核细胞也被染色，但从形态上可与内皮细胞鉴别，不作计数。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行数据处理。计量资料用s表示，组间比较采用成组设计资料两样本均数的t检验，多样本的比较用方差分析，一般相关性用简单相关分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MVD、β2-MG水平 见表1。

表1 MM患者实验组与对照组骨髓MVD及血清β2-MG水平比较(s)

表1 MM患者实验组与对照组骨髓MVD及血清β2-MG水平比较(s)

注:与对照组比较，*P＜0.01

组别 n MVD(个/HP) β2-MG(mg/L)实验组 34 33.07±11.24* 8.75±3.70*对照组30 10.56±4.06 1.96±0.70

2.2 骨髓MVD与ISS之间的关系 事后采用LSD进行两两比较，发现ISS分期为Ⅲ期MM患者［20例，年龄(39.73±8.33)岁］的骨髓MVD明显高于Ⅰ期［6例，(18.92±6.09)岁］和Ⅱ期患者［8例，(27.11±6.10)岁］，F=20.42、P＜0.01，且Ⅰ期、Ⅱ期之间骨髓MVD差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 治疗前后MM患者骨髓MVD、血清β2-MG水平的变化 见表2。

表2 治疗前后MM患者骨髓MVD及血清β2-MG水平比较(s)

表2 治疗前后MM患者骨髓MVD及血清β2-MG水平比较(s)

注:与治疗前缓解组比较，*P＜0.01

组别 n MVD(个/HP)β2-MG(mg/L)治疗前 治疗后缓解组 26 30.77±8.36 17.99±4.11* 7.94±2.86 2.79±0.94治疗前 治疗后*未缓解组 8 34.91±9.41 32.66±7.18 10.14±5.34 9.79±4.77

2.4 实验组骨髓MVD与血清β2-MG水平和ISS的相关分析 实验组骨髓MVD与血清β2-MG水平明显相关(r=0.607、P＜0.01)，骨髓MVD与ISS临床分期也明显相关(r=0.643、P＜0.01)。

3 讨论

骨髓血管新生在各种恶性血液系统疾病发生发展中的作用日益受到重视，研究证实多数恶性血液系统疾病骨髓MVD增加，其在血液系统恶性肿瘤中的作用以MM研究最早［2，5，6］。本研究发现初诊未治MM患者组较正常对照组骨髓MVD明显增高，而且治疗有效组较治疗前MVD明显下降，无效组则下降不明显。MM患者骨髓微血管较正常对照骨髓数量多，微血管部分呈逗点状、小管状或条索状，可见许多细小分支，血管形态幼稚，无明显的血管管腔，而正常骨髓组织的微血管管腔大，分支少见，形态较成熟。化疗后有效组部分见血管管腔稍增大，分支少见，接近对照组骨髓腔情况，部分患者改变不大;而无效组则仍见病理性血管新生明显。说明血管新生在MM的发病机理中有重要作用。有研究报告，血管内皮生长因子(vEGF)及其受体在MM患者明显增高，而vEGF及其受体是目前已知作用最强、特异性最高的血管新生正性调控因子，在肿瘤血管生成过程中发挥核心作用。vEGF通过自分泌与旁分泌作用途径，刺激瘤细胞的增殖与生存，并刺激内皮细胞的增殖及微血管生成，从而导致骨髓MVD增高［8］。因而，MM患者MVD明显高于对照组。治疗有效组治疗后MVD减少的原因考虑主要与化疗药对内皮细胞的直接和间接细胞毒作用有关:一方面化疗药直接作用于内皮细胞，产生的细胞毒作用导致内皮细胞调亡增加;另一方面化疗药通过杀伤骨髓瘤细胞，减少促血管形成的细胞因子分泌，间接抑制内皮细胞增殖。因此，治疗有效组经治疗后骨髓MVD较治疗前明显下降，这也说明骨髓MVD能反映患者近期疗效。本研究还发现，在接受治疗后，无论是无效还是缓解，骨髓中MVD高于正常对照组，这可能是残存的骨髓瘤细胞对内皮细胞的持续刺激导致血管生成增加，病理性血管新生对现有的治疗方法不够敏感，可能是目前MM不如其他一些恶性血液系统疾病疗效好的原因之一。

MM患者且活动期MM患者骨髓MVD明显高于非活动期患者［1，6］。肿瘤负荷高的MM患者明显高于肿瘤负荷低的患者。目前在MM患者中反映体内瘤负荷的水平通常用β2-MG和ISS临床分期。目前国内外研究报道多变量相关分析表明，β2-MG是所有参数中与肿瘤负荷最相关的参数，直接反映了MM患者体内肿瘤负荷，与患者生存期相关。而ISS临床分期最直接的依据就是血清β2-MG和ALB水平。本研究发现初诊未治的MM患者骨髓MVD与血清β2-MG水平明显相关，Ⅲ期患者骨髓MVD水平最高，Ⅱ期次之，Ⅰ期最低，三者之间差异具有显著性。这说明骨髓MVD可反映肿瘤负荷、分期和预后。研究表明MM肿瘤组织内新生的微血管主要分布在肿瘤生长活跃的边缘，也就是瘤负荷最高的区域。MM患者瘤细胞呈灶性分布，我们采用骨髓病理切片直接量化反映肿瘤的血管生成程度，它反映了肿瘤微血管形成的强度与肿瘤的侵袭性，且与肿瘤负荷相关［11］。这与我们研究报道的骨髓MVD与ISS临床分期及β2-MG呈正相关一致，因此，骨髓MVD可间接反映MM患者体内瘤负荷的水平。

综上所述，骨髓MVD可作为MM患者临床分期、疗效监测和预后判断的辅助指标。通过证实MM患者骨髓中存在血管新生现象，支持了关于血管新生可能是MM发病机制之一的假说［5］，为应用血管生成抑制剂这一新的治疗策略治疗恶性血液病提供了理论依据。

［1］Sezer O，Niemoller K，Jakob C，et al.Angiogenesis in multiple myeloma［J］.Leuk Res，2002，11(26):701-702.

［2］王晨，陈芳源，朱建善，等.多发性骨髓瘤患者血管内皮生长因子表达及血管生成的研究［J］.上海医学，2005，1(28):43-45.

［3］王京中，赵湜.多发性骨髓瘤患者血清β2-微球蛋白和C-反应蛋白水平的测定及其与病程和预后的关系［J］.临床内科杂志，2006，23(10):705.

［4］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.北京:科学出版社，2008:232-235.

［5］Vacca A，Ribatti D，Presta M，et al.Bone marrow neovascularization，plasma cell angiogenic potential，and matrix metalloproteinase-2 secretion parallel progression of human multiple myeloma［J］.Blood，1999，93(9):3064.

［6］高燕，丁慧芳，路希敬，等.恶性血液病患者骨髓微血管密度与凝血酶敏感蛋白-1的表达及意义［J］.山东医药，2011，9(51): 94-95.

［7］Kumar S，Witzig TE，Dispenzieri A，et al.Effect of thalidomide therapy on bone marrow angiogenesis in multiple myeloma［J］.Leukemia，2004，18(3):624-627.

［8］刘健，欧阳清，王玉春，等.多发性骨髓瘤患者血清β2-微球蛋白和C反应蛋白检测的临床意义［J］.检验医学与临床，2011，10 (8):1155-1156.

［9］Stachel D，Albert M，Meilbeck R，et al.Expression ofangiogenic factors in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia［J］.Oncol Rep，2007，17(1):147-152.

［10］Kakimoto T，Hattori Y，Okamoto S，et al.Thalidomide for the treatment of refractory multiple myeloma:association of plasma concentrations of thalidomide and angiogenic growth factors with clinical outcome［J］.Jpn J Cancer Res，2002，24(93): 1029-1036.

［11］Vacca A，Ribatti D，Presta M，et al.Evidence of increased angiogenesis in patints with acute myeloid leukemia［J］.Blood，2000，95(1):309-313.