溶出伏安法测定血清中维生素K3

史学丽，左志宇，王 方，魏翠梅，周宝宽

（1.天津医科大学化学教研室，天津300070；2.天津市兰立科化学电子高技术有限公司，天津300384）

维生素K3（vitamin K3,VK3），化学名2-甲基-1,4-萘醌，主要用于治疗VK缺乏引起的凝血酶原过多症，并参与人体的钙代谢[1]，近年来人们对VK3的关注集中在它能抑制癌细胞的作用上[2-3]，由于它对于人体的不可缺少性，一直是医学界、电化学界非常感兴趣的研究对象。目前报道的VK3的检测方法有高效液相色谱法[4]、分光光度法[5-6]、极谱法[7]、电化学发光淬灭法[8]等。这些方法各有优点，但有的仪器昂贵、测定繁琐，有的灵敏度低，并且VK3的化学性质活泼，见光易变性，需要快速测定，而高效液相色谱仪很难达到要求。近年来电化学方法由于其灵敏度高、选择性好、快速经济等优点，在分析领域得到了广泛地应用[9-10]，但采用电化学方法对人血清中VK3的测定尚少见报道。本文采用差分脉冲溶出伏安法[11]对血清中的VK3含量进行了测定并与高效液相色谱法进行了比对。

1 材料和方法

1.1 主要仪器 LK2006电化学工作站（天津兰立科化学电子高技术有限公司）；三电极体系：玻碳电极（GCE，A-0.1256cm2）为工作电极，Ag/AgCl电极参比电极、铂片电极为对电极；Agilent 1100HPLC工作系统（Agilent公司，美国）。

1.2 试剂 VK3（批号：100029-200009）购自中国药品生物制品检定所；镀汞液自配；甲醇、氯仿为色谱纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司；氨水、氯化铵等试剂皆为分析纯；实验用水为二次去离子水。

镀汞液的配制：精密称取硝酸汞0.3246g，用1∶1硝酸（1～2mL）溶解，然后用二次去离子水定容至1L容量瓶中，配成浓度为10-3mol·L-1的溶液。

1.3 VK3标准溶液的配制 称取50.00mgVK3标准品溶于适量无水乙醇中，定容至100mL棕色容量瓶，暗处避光保存，使用时稀释成所需浓度的溶液。

1.4 血清样品预处理 将3mL正常人血样品置5mL的塑料离心管中，高速离心10min（4000r/min），取上清液2mL于40℃水浴上用氮吹仪吹干，残渣用2mL NH3·H2O/NH4Cl缓冲液（1.0mol·L-1）溶解待测，色谱法用三氯甲烷溶解残渣。

1.5 色谱条件及测定 色谱柱：Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：室温；检测波长：250nm；流动相：甲醇∶水=65∶35；流速：1.0mL·min-1；进样量：20μL。称取一定样品于10mL棕色容量瓶中，用甲醇-水（65/35，V/V）定容，超声振荡10min，离心，供进样用。

1.6 镀汞膜玻碳电极的制备 玻碳电极用HNO3溶液（1+1）浸泡抛光后，依次用无水乙醇、去离子水超声清洗，吸干电极表面水分并在空白底液（1mol·L-1NH3·H2O/NH4Cl）中扫至无峰，然后以铂片电极为对电极，Ag/AgC1电极为参比电极，将三电极置于镀汞液中，在电流-35μA、间隔时间0.01s、采样点数30000条件下镀汞膜，制得汞膜玻碳电极。

1.7 VK3的测定 以汞膜玻碳电极与对电极铂片电极、参比电极Ag/AgC1组成三电极体系，以pH=9.4的1.0mol·L-1的氨水-氯化铵缓冲溶液为底液[11]，加入一定量VK3标准品溶液，设置初始电位-10mV，终止电位-700mV，电位增量0.005V，脉冲宽度0.05s，脉冲幅度20mV，脉冲间隔0.1s，电沉积时间45s，平衡时间15s，在-10～-700mV范围内进行差分脉冲溶出伏安扫描，记录峰电流及峰电位。

2 结果

2.1 实验条件的选择

2.1.1 底液的选择 选用氨水-氯化铵缓冲液作为底液，发现VK3在1.0mol·L-1（pH=9.4）的氨水-氯化铵缓冲液中在-0.224V处左右出峰，峰形好，灵敏度高。见图1。

2.1.2 pH对峰值的影响 在氨水-氯化铵缓冲溶液中在不同的pH值条件下进行扫描，发现VK3在pH= 9.4的氨水-氯化铵缓冲液中灵敏度最高，因此以下的研究均采用pH=9.4的氨水-氯化铵缓冲溶液。

2.1.3 富集时间对峰高的影响 对0.46ng·mL-1浓度的VK3进行测定，发现随着富集时间的提高，峰电流增加，峰形趋于整齐，富集时间超过40s，峰电流变化不大甚至下降，峰形出现明显拖尾，因此选择富集时间为40s，见图2。

图1 VK3在氨水-氯化铵缓冲液中的扫描图Fig 1 Scanogram of VK3in the buffer of NH3·H2O/NH4Cl

图2 富集时间T对峰电流ip的影响Fig 2 The influence of peak electric current ipfrom accumulation time T

2.2 重现性 在选定的最佳实验条件下对浓度为0.92ng·mL-1的VK3标准品溶液，在24h内测定6次，根据实验结果计算相对标准偏差RSD为1.64%，重现性良好。

2.3 线性范围和检出限 取2mL浓度为1.0mol·L-1氨水-氯化铵空白缓冲液分别加入5、10、15、20、25、30、35μL VK3标准品溶液，测试体系相应的浓度为0.23、0.46、0.69、0.92、1.2、1.4、1.6ng·mL-1，按上述1.6的测定方法，测定VK3的含量，建立标准曲线。以VK3的浓度为横坐标，峰电流为纵坐标，采用最小二乘法进行回归计算。线性方程为：Y=0.072X-0.280，r2=0.999，表明浓度在0.23～1.6ng·mL-1内，与峰电流值呈良好的线性关系，最低检测限位0.23ng·mL-1。见图3。

2.4 回收试验 取一定量含量VK3的正常人血清共3份，按1.4方法处理，测定VK3的浓度为C1，然后加入一定量标准品（大约分别相当于VK3含量的80%、100%、120%），测定血清和VK3标准品混合物的浓度为C2，每份各测定3次，计算回收率为99.91%，RSD为1.03%（n=9）。

图3 VK3标准品溶液的标准曲线Fig 3 The standard curve of the solution of standard substance VK3

2.5 血液样品中VK3的测定 取适量血液样品按1.4方法进行处理，在上述的测试条件下对6个样本进行测定，每样本测定3次代入标准曲线计算含量。另取同批样品，按高效液相法测定，结果见表1。

表1 血清中VK3含量测定结果Tab 1 Determination result of VK3in seurn

3 讨论

近20年来，国内外的电化学分析测试仪器得到了蓬勃发展。1992年，朱果逸等[12]就曾对国外电化学分析仪器的进展进行过总结。目前，国外已有多家公司生产了多种系列的电化学分析测试系统/工作站。虽然从整体上看国内的电化学分析测试仪器较之国外产品尚有差距，但近年来国内的研究、开发、生产还是比较活跃的。20世纪80年代，现代电子技术和微机与电化学方法结合，建立了微机联用电化学分析测试系统，使我国的电化学分析测试仪器的发展步入了一个新的阶段；20世纪90年代后期，其发展逐渐迈向成熟，硬件集成化，软件程序模块化、多样化，并集多种功能为一体。这些进步使电化学仪器的测量速度、精度、准确度、分辨率得到较大提高，为电化学家提供了更为有效的研究方法，同时也促进了电化学分析仪器的广泛应用。

本文采用溶出伏安法测定血清中VK3的含量，之前也有对用此方法测定VK3的报道[11]。鉴于血清中影响测定的因素多，测定结果重现性差等原因，我实验室采用预镀汞膜玻碳电极，对电极进行了修饰，结果显示用修饰技术三电极伏安法测定溶液中VK3含量，与高效液相色谱法、紫外分光光度法等测定方法相比较，其各有优点和不足，但该方法建立在电化学实验手段的基础上，其方便快捷、简单易行、安全且代价小是显而易见的。做为提供一种新的测试方法和技术手段，具有一定的借鉴价值和创新意义。正是基于这一点，缺陷和不足也是在所难免的，有进一步探索和完善的必要。

目前对VK3的测定以高效液相色谱法居多，其优点在于测定结果准确并且可以将VK3的同分异构体进行分离，但无法减少VK3在测定过程中发生氧化，所以缩短测定时间、避免光照是减少氧化的必要措施。实验结果表明电化学工作站检测结果的RSD均明显小于Aiglent1100高效液相色谱法，表明电化学工作站的检测精密度高、重复性好；电化学工作站的检测值普遍比Aiglent1100高效液相色谱法高，其可能原因（1）VK3化学性质不稳定，而高效液相色谱法测定时间长，可能致使少量VK3变性。（2）高效液相色谱法中采用三氯甲烷做溶剂溶解VK3，较之电化学工作站中用无水乙醇的溶解效果稍差。但电化学法的抗干扰能力相比高效液相色谱会稍显不足，对条件的要求严格，这是今后要克服的问题。

通过上述研究建立了差分脉冲溶出伏安法分析测定血清中VK3的方法，该方法操作简便，检测灵敏度高，检出限达0.23ng·mL-1；测定结果准确度高，回收率为99.91%，RSD＜5%。含量测定方法学考察研究表明，采用预镀汞膜电极的差分脉冲溶出伏安法测定VK3的含量，方法稳定可行，并且由于其测定时间短，取样少，成本低，灵敏，快速，因此可用于临床普及。

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［7］ 袁倬斌，张钧.维生素K3的单扫描示波极谱法和新极谱法研究[J].分析化学，1989，17(4):312

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［11］毕淑云，张敬东，刘英红，等.溶出伏安法对维生素K3的研究与测定[J].理化检验:化学分册，2006，42（6）:455

［12］朱果逸，张月霞.国外电化学分析仪器进展[J].现代科学仪器，1992(2):19