糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节细胞凋亡的影响*

朱智耀，高彦彬，邹大威，李步满，彭继升

糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一。其发病机制目前有多种学说，其中氧化应激引起的细胞凋亡在DPN的发生发展中发挥重要作用［1-3］。中药复方糖络宁治疗DPN的疗效在临床和实验研究中已得到初步证实［4-8］。本实验通过观察糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节(DRG)细胞凋亡、半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表达的影响，进一步探讨其治疗DPN的作用机制，为更好地指导临床用药提供理论及实验依据。

1 材料

1.1 动物

SPF/VAF级雄性8周龄 SD大鼠，体重180g～220g，由北京维通利华实验动物公司提供。分笼饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室，环境温度控制在 20℃ ～25℃，相对湿度 40% ～70%，12/12h光照/黑暗循环。实验期间大鼠自由进水和进食。

1.2 药物

中药制剂糖络宁浸膏(主药为生黄芪、生地、牛膝、狗脊、丹参、川芎等)由北京中医药大学东方医院制剂中心提供，1ml浸膏含生药3g。

1.3 试剂

链脲佐菌素为美国 Sigma公司，兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体为美国 Cell Signaling Technology公司产品，原位细胞凋亡检测试剂盒为Roche公司产品(天津灏洋生物分装)，两步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒、Mayor，s苏木素均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 仪器

Olympus BX51显微镜、Olympus DP71摄像系统、稳豪血糖仪以及血糖试纸(美国LifeScan，Inc)。

2 方法

2.1 模型建立与分组处理

选用雄性SD大鼠适应性喂养1周，随机选择8只为正常对照(control)组，其余大鼠禁食不禁水12h后，将链脲佐菌素(STZ)溶入柠檬酸缓冲液(p H值=4.2～4.5)配制成1%的溶液，按60mg/kg给予一次性腹腔注射(control组大鼠注射等体积的柠檬酸缓冲液)。72h后大鼠禁食8h断尾取血，测血糖≥16.7mmol/L视为糖尿病造模成功，造模成功大鼠随机分为模型组(model)、糖络宁组(TLN)，每组8只，随即开始灌胃。糖络宁组按生药10g/(kg·d)灌胃，模型组给予等量蒸馏水灌胃，连续给药32周。

2.2 一般情况观察与血糖测定

观察各组大鼠毛色、精神状态、摄食量、饮水量、尿量、日常活动情况等;禁食8h后尾静脉采血，4周测定1次血糖。

2.3 免疫组化检测DRG中Caspase-3表达

切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗后滴加封闭液，室温孵育10 min甩去多余液体。滴加1∶150稀释的一抗(Caspase-3多克隆抗体)，4℃过夜(并同时用PBS代替一抗作为阴性对照)。次日PBS冲洗，滴加聚合HRP标记抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染、脱水透明、封片。从Caspase-3在背根神经节中表达结果判断，清晰的背景上胞质和(或)核棕黄色为阳性表达，阴性对照无特异性着色。

2.4 DNA末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡

切片脱蜡至水，蛋白酶 K室温消化30min后，PBS洗片，与阻断剂(0.3%H2O2甲醇溶液)室温孵育30 min，PBS洗片。滴加50ul的 TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37℃孵育60 min，PBS冲洗后加入50ul转化剂-POD，在湿盒中 37℃孵育 30 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木素复染，脱水透明、封片。光镜下观察细胞核中出现棕黄色颗粒者为TUNEL染色阳性细胞。

2.5 图像分析

每张切片在400倍光镜下选取4个互不重叠的视野，使用Image Pro-Plus 5.0.1图像分析软件半定量测定每个视野中所有阳性像素的积分光密度值(IOD)，取均值为Caspase-3的结果;TUNEL结果用凋亡神经元的阳性百分率表示，取均值为TUNEL的结果。

2.6 统计学分析

计量资料以均数±标准差(珋x±s)表示，多组均数比较采用方差分析，所有数据均经SPSS13.0软件处理，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况观察

正常组大鼠精神状态良好，毛色有光泽，进食和饮水量以及尿量都正常，体重增加明显，活动自如。模型组大鼠进食和饮水量以及尿量都明显增多，神态萎靡，毛竖无光泽，尾巴苍白湿冷，蜷卧拱背，活动少，体重增长缓慢。糖络宁治疗组的大鼠表现与模型组类似，但程度较轻。

3.2 糖络宁对大鼠血糖值的影响

表1显示，与正常对照组比较，造模后大鼠血糖明显升高(P＜0.05)，同时在未进行糖络宁干预前(0周)，TLN组与模型组血糖值无差异(P＞0.05)。在TLN干预8周后大鼠血糖开始下降，与模型组相比有统计学差异(P＜0.05)。

表1 糖络宁对大鼠血糖值的影响

3.3 糖络宁对大鼠背根神经节神经元凋亡阳性率的影响

表2图1显示，模型组背根神经节神经元的凋亡率与正常对照组相比明显增加，有统计学差异(P＜0.05);糖络宁组的凋亡率低于模型组，有统计学差异(P＜0.05)。

图1 背根神经节TUNEL染色图片(×400)

3.4 糖络宁对大鼠背根神经节Caspase-3蛋白表达的影响

表2图2显示，Caspase-3免疫组织化学染色显示在正常大鼠背根神经节中仅有少量阳性反应。模型组染色呈强阳性反应，棕黄色颗粒状弥漫分布于胞浆中。经图像分析处理，模型组积分光密度值与正常对照组相比明显增多，有统计学差异(P＜0.05)。糖络宁干预后，大鼠背根神经节Caspase-3的表达减少，其积分光密度值与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)。

4 讨论

细胞凋亡主要通路分别为死亡受体介导的凋亡途径(外在途径)和线粒体凋亡途径(内在途径)［9］，内外途径都是通过激活caspase家族引起细胞凋亡，在caspase蛋白家族中caspase-3又是研究的焦点，几乎有关caspase的所有凋亡途径最终都是通过激活caspase-3导致细胞凋亡［10］。Caspase-3酶原激活后可切割不同底物，形成蛋白酶级联切割放大机制，最终导致细胞凋亡形态学和生化特征的形成。细胞凋亡的生化学特征主要是细胞核内的染色质在核小体间断裂［11］，产生若干大小不一的寡核苷酸片段。TUNEL检测是1种将细胞凋亡时DNA断端进行标记的方法，它的检测原理是荧光素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下连接到凋亡细胞中断裂DNA的3-OH末端，而荧光素能被结合有过氧化物酶的抗荧光素抗体识别，最后利用过氧化物酶与其底物反应而标记出凋亡的细胞核。该方法是最为常用的检测凋亡手段之一，优点是灵敏度高，特异性强，可原位显示凋亡细胞及其分布。

表2 糖络宁对大鼠背根神经节神经元凋亡阳性率及Caspase-3蛋白表达的影响

图2 背根神经节Caspase-3蛋白表达图片(×400)

糖尿病周围神经病变是多因素共同作用的结果，细胞凋亡在DPN的发生发展中发挥重要作用。关于DPN细胞凋亡的研究主要集中在背根神经节和坐骨神经，本研究以背根神经节为主。Srinivasan等［12］认为，糖尿病大鼠背根神经节细胞凋亡的增加是DPN的致病因素。Schmeichel等［13］研究也发现，糖尿病大鼠随病程的延长，DRG神经元凋亡率逐渐上升，且Caspase-3蛋白表达和DRG神经元凋亡与DNA氧化损伤存在明显相关性，支持氧化损伤导致细胞凋亡。另外，通过体外对DRG神经元的培养发现，随着培养基中葡萄糖增加，神经突的退变和细胞凋亡增加［14］。在本实验中，模型组同样也出现DRG中Caspase-3表达增加、神经元凋亡率上升的现象，在应用糖络宁干预后细胞凋亡有明显改善，提示糖络宁有抑制凋亡的作用。另外，本实验还观察到糖络宁有一定降低大鼠血糖的功效。

现代医学对于DPN的治疗尚无理想方法。糖络宁以生黄芪、生地、牛膝、狗脊、丹参、川芎等为主要组成，具有益气养阴、滋补肝肾、活血通络之效。经多年临床验证，可以明显改善患者肢体麻木、疼痛、反射减弱等神经系统症状，对神经传导速度、末梢微循环积分以及患者氧化应激状态均有改善作用，在治疗过程中未见明显的不良反应［4、5］。同时动物实验证明，糖络宁可有效提高糖尿病大鼠坐骨神经传导速度，改善糖尿病大鼠的痛觉异常以及氧化应激状态［6、8］。本实验结果表明，糖络宁能抑制DRG中神经元凋亡，从而起到神经保护作用，这可能为DPN治疗提供新思路，为DPN临床防治用药提供实验依据，但糖络宁是通过何种凋亡通路发挥作用有待进一步研究。

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