我国不同地区麦蚜携带BYDV－GAV比率的差异

杨 菲， 吴茂森， 陈华民， 田 芳， 曲 玲， 曹雅忠， 何晨阳＊

（1．中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2．宁夏农林科学院，国家枸杞工程技术研究中心，银川 750002）

麦类黄矮病是一种分布广泛、危害严重的禾谷类病毒病，由蚜虫携带大麦黄矮病毒进行传播。国外于1951年首次报道，发生在美国加利福尼亚州大麦上［1］。1960年在我国陕西、甘肃的小麦上发现。1966－1999年间，由于蚜虫介体的猖獗，在我国北方冬春麦产区多次造成病毒病流行，损失极大［2－5］。

我国小麦黄矮病以减少蚜虫数量和选育推广抗性品种为主要防治途径［6］，因此对蚜虫进行预测预报十分重要。成卓敏等于1992年报道了在实验室内对蚜虫饲毒，成功进行单头蚜虫带毒检测的试验［7］，但目前还没有对田间蚜虫带毒情况进行检测研究的报道。本研究以我国小麦黄矮病重病区和非重病区小麦抽穗期的麦蚜为研究对象，运用RTPCR方法检测单头蚜虫携带大麦黄矮病毒的情况，明确我国不同地区田间蚜虫带毒率的差异，为阐明田间蚜虫带毒率与小麦黄矮病发病情况的关系提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

蚜虫样本分别采自我国小麦主产地山西、甘肃、青海、陕西、河南和河北等地区黄矮病重病区和非重病区小麦田间植株。PCR引物由Invitr ogen公司合成。RNA提取试剂Trizol、Super Script®Ⅲ反转录酶购自北京Invitrogen公司，RNase抑制剂、d NTPs购自Ta Ka Ra公司，其他试剂均为国产分析纯。

1．2 方法

1．2．1 RNA提取

离心管中放入单头蚜虫，在液氮冷冻条件下用玻璃棒研碎，加入400μL Trizol试剂进行萃取，80μL氯仿用于抽提，加入大于上清体积60% 的异丙醇沉淀RNA，沉淀经75%乙醇洗涤风干后，溶于适量DEPC水，立即进行反转录或置于－80℃保存备用。

1．2．2 引物设计

根据GenBank中BYDV－GAV外壳蛋白基因序列比较设计合成一对特异引物，GAVCP 1：5′－AGTTCGGAGAATGGTTGTGG－3′；GAVCP 2：5′－TTGTAACGGTGGTAGGACTTG－3′。

1．2．3 RT－PCR

参照Super Script®反转录试剂盒说明书进行总RNA反转录，获得c DNA。

以2μL c DNA为模板，依次加入10×缓冲液2．5μL，d NTPs（2．5 mmol／L）1．0μL，上下游引物（10μmol／L）各0．5μL，Taq酶（2．5 U／μL）0．5μL，dd H2O补足反应体积至25μL。扩增程序为：94℃，3 min；（94℃30 s，61℃30 s，72℃1 min）×32个循环。

1．2．4 RT－PCR灵敏度测定

为确保检测结果的灵敏度和可靠性，选择已知的单头带毒蚜虫c DNA样品系列稀释后进行PCR扩增，电泳检测体系的灵敏度与特异性。

1．2．5 RT－PCR检测蚜虫带毒率

于小麦抽穗期分别从山西、甘肃、青海、陕西、河南和河北等地麦田采集BYDV－GAV介体蚜虫麦二叉蚜及麦长管蚜，每个采样点取蚜虫200头，分别提取RNA，参照1．2．3的方法进行 RT－PCR分析，计算蚜虫带毒率。

2 结果与分析

2．1 检测体系灵敏度测定

对单头带毒蚜虫c DNA样品系列稀释后的PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明（图1），c DNA模板稀释200倍时，仍可见清晰的特异扩增条带，并且为唯一扩增产物，经序列测定，确定与GAV外壳蛋白基因序列一致。表明所建立的检测体系具有较高的灵敏度和特异性，测定样本用量可少至1／200头蚜虫。

图1 RT－PCR灵敏度检测结果

2．2 蚜虫带毒率测定

对采自不同麦区的蚜虫样本进行RT－PCR检测，从图2的琼脂糖凝胶电泳结果可见，蚜虫样本PCR扩增条带清晰特异，与阳性对照大小一致。蚜虫带毒率测定的统计结果表明，不同地区麦田蚜虫带毒率存在明显差异（表1），采集自重病区小麦田的蚜虫具有较高的带毒率，山西汾阳和甘肃渭源的发病麦田蚜虫的带毒率达到了90%以上；发病稍轻的陕西杨凌麦田蚜虫带毒率也达到了56%；其他重病区麦田蚜虫带毒率均在70%以上。对非重病区的河南和河北小麦田蚜虫检测结果，带毒率显著较低，表明小麦田间蚜虫带毒率与小麦黄矮病发生严重度具有直接的相关性。

图2 各地区蚜虫带毒情况检测结果

表1 各地区蚜虫带毒率统计结果

3 结论与讨论

本研究通过设计BYDV－GAV特异引物，建立了田间单头蚜虫携带小麦黄矮病病毒的RT－PCR检测方法。该方法具有较高的灵敏度和特异性，测定样本用量可少至1／200头蚜虫。与成卓敏等人测定样本用量少至1／20头蚜虫［7］相比，本方法具有更高的灵敏度。

为明确我国不同地区麦蚜携带BYDV－GAV比率的差异，本研究利用上述方法对采自不同麦区的小麦蚜虫携带小麦黄矮病病毒的情况进行了检测。发现采自重病区的麦蚜带毒率高，而非重病区则带毒率低。因此，蚜虫带毒率的高低与当地小麦黄矮病发生严重度呈正相关性。此检测体系可成功应用于田间蚜虫携带小麦黄矮病病毒的检测，并可进一步用于田间蚜虫群体带毒率与黄矮病发病率关系的定量分析。由于除气象因素外，越冬和早春蚜虫数量及有蚜株率也都是黄矮病流行与否的关键因素［8］，因此可将此体系应用于对越冬和早春田间蚜虫样本携带大麦黄矮病毒的检测，从而为小麦黄矮病的预测预报提供科学依据。

在本研究工作的基础上，后续试验正在利用RT－Q－PCR技术，定量检测单头蚜虫携带的病毒量、不同饲毒时间蚜虫带毒量的变化，阐明单头蚜虫带毒量与成功传毒的关系。

［1］ Oswald J W，Houston B R．A new virus disease of cereals trans mitted by aphid［J］．Plant Disease Report，1951，35：471－475．

［2］ 周广和，成卓敏，张向才，等．麦类病毒病及其防治［M］．上海：上海科学技术出版社，1987：8．

［3］ 张鸿杰，徐建兵．1999年小麦黄矮病流行原因及其防治对策［J］．小麦研究，2000，21（3）：33－35．

［4］ 赵多长．天水市1999年小麦黄矮病流行原因分析与综防对策［J］．甘肃农业科技，2000（4）：38－39．

［5］ 王小明．秦安县1999年小麦黄矮病发生情况调查［J］．甘肃农业科技，2000（5）：35－36．

［6］ 谢皓，陈孝．我国抗黄矮病小麦研究进展［J］．北京农学院学报，1999，14（2）：55－57．

［7］ 成卓敏，Waterhouse P M，王立阳，等．应用聚合酶链式反应方法检测携带大麦黄矮病毒的单头蚜虫［J］．病毒学报，1992，8（1）：80－84．

［8］ 相建业，冯崇川．小麦黄矮病预测预报［J］．植物保护学报，1994，21（1）：73－78．