甜瓜自交系不定芽再生过程中内源激素含量的变化

张慧君 栾非时 王学征 高 鹏 牛明明

（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）

离体形态发生是高等植物生长发育研究中一个复杂的问题，受多种内外因素的影响，至今尚未彻底掌握其规律。植物激素对形态发生起着重要的作用，外植体离体培养形态建成，往往需要外源激素的诱导。然而，外源植物激素必须通过对内源激素平衡的调节才能起作用（李代丽和康向阳，2007）。植株生长发育过程与植株内源和外源激素的种类、含量及配比等有密切关系，裴东等（1997）、邵继平（2003）、Zhang 等（2008）、田春英等（2010）、Huang 等（2012）的研究表明，内源激素对红富士苹果、菊花、水稻愈伤、南瓜不定芽形成和分化起重要作用；目前关于甜瓜（Cucumis meloL.）再生过程中内源激素的研究还未见报道。本试验拟对甜瓜子叶节外植体的不同内源激素含量及其在离体培养过程中的变化进行研究，以了解甜瓜在离体培养条件下内源激素的变化规律，为合理添加外源激素以诱导甜瓜离体形态发生提供理论依据和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2010年9月～2011年1月在东北农业大学西甜瓜分子育种实验室进行。供试甜瓜品系M1-16、M1-15、M1-19、M1-23 均来自东北农业大学西甜瓜分子育种实验室，均为纯合自交系，分别编号为品系1、品系2、品系3、品系4。其中再生能力强弱依次为品系4＞品系2＞品系1＞品系3。

1.2 方法

无菌苗的培养：取籽粒饱满、大小均一的甜瓜种子，温汤浸种4～5 h，流水冲洗，在超净工作台上先用75%酒精浸泡1 min，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10～15 min，轻轻摇动，最后用无菌水冲洗5～6次，将种子平放于1/2 MS 培养基（每升含蔗糖30 g、琼脂7 g，pH值5.8）上。28℃暗培养1～2 d，50%种子露白后转至光照下培养，培养条件为25℃，光照16 h·d-1、黑暗8 h·d-1，光照强度为40 μmol·m-2·s-1。

不定芽的诱导：取5 d 左右两片子叶脱离种皮、但未完全张开的甜瓜无菌苗，切去生长点及下胚轴，两片子叶均切去上半部分（1/2～1/3），留取子叶下半部分，将子叶节接种于芽诱导培养基，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IAA（Zhang et al.，2011）；培养条件同上。然后分别取接种培养0 d、7 d（启动分化时期）、14 d（芽原基形成时期）、21 d（不定芽膨胀时期）、28 d（不定芽开始伸长时期）的叶片用液氮速冻，置于-70℃冰箱中保存待测。

1.3 生理指标的测定

内源激素含量的测定采用酶联免疫法，试剂盒由中国农业大学提供；每一指标的测定均重复3次，应用DPS 软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 内源激素含量的变化

2.1.1 内源IAA含量的变化 如图1所示，不定芽诱导过程中甜瓜各品系间内源IAA 的含量变化较大。4个品系在幼叶、不定芽形成过程中内源IAA含量经历了由高到低的变化过程，但品系间有明显差异。0 d时品系1 和品系4 IAA含量较高，0～7 d 急速下降，7 d 以后下降趋于平缓；品系3 一直呈缓慢下降趋势；品系2 则0～7 d 稍有上升，随后下降。

2.1.2 内源ABA含量的变化 由图1可以看出，虽然各甜瓜品系间在不同培养阶段内源ABA 的含量存在较明显的差异，但均随着不定芽诱导进程而呈现高—低—高的变化趋势。在诱导初始阶段，各品系内源ABA含量均急剧减少，其中品系4 在7 d时最低。品系1、品系2 和品系4变化趋势相近，而品系3 内源ABA含量在21 d时又很快回升，此时品系4 ABA含量最低。品系4 内源ABA含量在7～28 d 一直保持较低水平。

图1 甜瓜自交系不定芽再生过程中内源激素含量的变化

2.1.3 内源ZR含量的变化 4个甜瓜品系在不同培养阶段内源ZR含量及变化幅度差别较大（图1）。品系4 不定芽再生过程中的内源ZR含量均显著高于其他品系，在第14 天达到最高值，然后下降；其他3个品系ZR含量都比较低。可见较高的ZR含量有利于再生。

2.1.4 内源GA3含量的变化 由图1可以看出，0 d时4个甜瓜品系内源GA3含量均为最高值，其中品系4 GA3含量最高，品系3 最低，可见，此时的GA3含量与品系再生能力有一定的联系。随着愈伤组织诱导和再生植株分化，内源GA3含量逐渐下降，启动分化期（0～7 d）的下降幅度较大。第21 天时品系2、品系4 GA3含量略微回升。

图2 甜瓜自交系不定芽再生过程中内源激素比值的变化

2.2 IAA/ZR、IAA/ABA、ZR/ABA 的变化

甜瓜子叶节在组培过程中内源激素含量不断变化，进而使得 IAA/ZR、IAA/ABA、ZR/ABA 的比值也不断发生变化，不同品系间也有较明显的差异（图2）。0 d时品系4 IAA/ZR的比值最低，而且一直保持较低水平。0 d时，品系4 IAA/ABA 出现最高值，且在21 d 和28 d时也比其他品系都高；21 d时品系3 IAA/ABA值最低，可见，较低的IAA/ABA值不利于再生。品系4 ZR/ABA 的比值在整个再生过程一直保持较高水平，可见ZR/ABA 的比值与再生率呈正相关。

2.3 子叶节接种不同时期的变化

从图3可以看出，品系4 子叶节接种7 d 左右细胞开始启动分化，以后进行旺盛分裂，到14 d时即形成芽原基，21 d时外植体上形成肉眼可见的不定芽。品系4 ZR/ABA 的比值远高于其他品系，特别是在启动分化时期，这表明在此阶段内源ZR含量占有绝对优势，而其内源ABA含量较少。可见，为了获得足够的再生植株，在此阶段应保持较高的细胞分裂素水平。

图3 甜瓜自交系（品系4）子叶节不定芽再生的不同时期

3 结论与讨论

从本试验不同时期各外植体的IAA 水平来看，甜瓜子叶节接种0 d时保持相对较高的IAA水平，有利于形成芽原基，这与前人的观点（郭子彪和盖均镒，1997；陶静 等，1998；Ali et al.，2009）相同。GA3在形成启动分化时期含量急剧下降，到了中后期含量变化不大，可见甜瓜形成不定芽前对GA3的需求量较大，而在不定芽形成后GA3含量变化相对平稳，这与Jiménez 和Bangerth（2001）对胡萝卜的试验结果一致。ABA含量在不定芽诱导初期明显下降而后有所上升，中后期品系4 一直保持很低的水平，可见在形成不定芽后其含量的下降有利于芽的进一步生长。品系4 ZR含量一直保持较高水平，14 d时最高，说明较高的ZR含量有利于不定芽的诱导，但是一旦芽原基形成，其需求量也随之降低，只需维持不定芽的生长即可，这与朱丽华等（2006）关于大白菜下胚轴愈伤组织不定芽发生过程的研究结果相似。

植物体的各种生理效应是内源激素相互作用的结果（肖关丽和杨清辉，2001），不同种类植物激素的生理效应相互促进或相互拮抗，一种激素的变化往往伴随着多种激素的相应变化，不定芽再生过程中引起形态变化的某一个反应往往是多种激素间综合作用的结果。本试验结果表明，较易再生的品系4 的内源IAA/ZR 的含量一直较低，而ZR/ABA 在整个再生过程中一直保持较高水平，表明较低的IAA/ZR 比值和较高的ZR/ABA 比值有利于甜瓜子叶节的再生。4个甜瓜品系的IAA/ABA 在0 d时比值均处在较高水平，而后下降，不同品系间差异不明显。

植物离体培养的器官发生受到植物体内环境和外部培养条件的影响，其中内源激素的调控非常重要，外源激素必须通过对内源激素的调节来达到控制器官发生的目的，各种生长调节物质都通过影响培养物的基因表达从而影响器官分化（黄学林和李莜菊，1995）。而内源激素需要与受体或载体结合，通过信号转导和传递方式的不同而控制不同的生理功能，本试验只是研究了甜瓜不定芽产生的不同时期内源激素含量和比值与甜瓜再生能力之间的关系，但这些激素在分子水平上通过何种途径来调控甜瓜再生的作用机制仍有待深入研究。

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