贯叶连翘中黄酮类化合物的提取及含量测定

宋宏新, 杨 芳

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

贯叶连翘HypericumperforatumL.为藤黄科金丝桃属植物，多年生草本，全草入药，别名有千层楼、小叶金丝桃等，在西方国家又名“St John′s wort”.在我国主要分布在陕西、贵州、四川、甘肃、江苏等地[1].大量临床研究己经证实贯叶连翘对中、轻度抑郁症有效，且副作用较传统的化学抗抑郁药物轻微，其有效成分有抗病毒，抗癌抗肿瘤以及治疗肝炎，白血病等多种药理作用[2].传统中医认为，贯叶连翘具有清心明目、调经活血、止血生肌的功效，现代药理研究表明，贯叶连翘具有抗抑郁、抗病毒、抗菌、镇痛等作用[3]，近来的研究表明黄酮类成分是贯叶连翘中具有抗抑郁作用的成分之一[4].贯叶连翘已列入美国、前苏联、波兰、罗马尼亚、瑞士等国药典[5].本实验以黄酮类化合物的得率为指标，分别考察了提取溶剂的浓度、提取时间、提取次数、料液比对提取率的影响，以芦丁为对照品通过比色法测定贯叶连翘提取液中总黄酮含量对该方法进行了考察.

1 材料与仪器

752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

贯叶连翘药材(购自西安市药材市场，经西北农林科技大学陈彦生研究员鉴定)；芦丁标准品(购自中国药品生物制品药检所，批号为0080-9705)；甲醇、乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH均为分析纯，水为蒸馏水.

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量的测定

贯叶连翘提取液中总黄酮的含量采用分光光度法在硼酸-NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色系统作用下于510 nm下测定[6].标准品溶液以精密称取干燥恒重的芦丁标准品1.50 mg，用80%的乙醇配制100 mL，即得15μg/mL的标准贮备液.

精密吸取芦丁标准液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于25 mL容量瓶中，加显色剂后于可见分光光度计510 nm下测吸光度.以吸光度(A)为纵坐标，标准液的浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线.用最小二乘法进行回归，得芦丁的回归方程为A=0.011C+0.0031，R2=0.9992，芦丁在0.015-0.075 mg/mL浓度范围内线性关系良好.

称取一定量的贯叶连翘干燥药材粉末，加入溶剂，超声提取，所得提取液吸取一定量于容量瓶中，分别加1%的硼酸、5%的NaNO2、10%的Al(NO3)3、1mol/L的NaOH等显色剂后，于510 nm下测定各提取液的吸光度值，带入回归方程，计算得黄酮类化合物的含量，即每克贯叶连翘干燥药材中提取出的黄酮类化合物的质量，计算公式为：

每克干药材中黄酮类化合物的含量=(C×V×f)/w，其中，C是被测溶液的浓度，V是定容后的体积，f是稀释倍数，w为贯叶连翘干燥药材的质量.

2.2 贯叶连翘中黄酮类化合物的提取

取贯叶连翘药材粉碎过80目筛，加入溶剂，超声提取.

2.2.1单因素实验

(1)超声时间对得率的影响

称取2.5g药材粉末4份，以料液比1∶10，加入80%的乙醇，在45℃下超声提取3次，每次的超声时间分别是30 min、45 min、60 min、75 min，抽滤后收集滤液并用乙醇定容至100 mL容量瓶中，吸取0.5mL提取液于25 mL容量瓶中，按照2.1的方法测吸光度，得黄酮类化合物得率与提取时间的关系(见图1).

图1 得率与提取时间的关系

从图中数据分析可知，在提取试剂、超声温度、试剂浓度、提取次数以及料液比等条件相同的前提下，进行不同时间的超声辅助提取，所测定的提取液的吸光度有显著差异，而且当超声处理时间为60 min时，提取液中黄酮类化合物的含量最大.

(2)溶剂浓度对得率的影响

称取2.5g药材粉末5份，以料液比1∶10，分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在45 ℃下超声提取3次，每次45 min，抽滤后收集滤液，同上测定吸光度，得黄酮类化合物得率与溶剂浓度的关系(如图2所示).

从图中数据分析可知，在提取试剂、超声温度、提取次数、时间以及料液比等条件相同的前提下，以不同浓度的乙醇为溶剂进行超声辅助提取，所测定的提取液的吸光度有显著差异，而且当乙醇的体积分数为60%时，提取液中黄酮类化合物的含量最大.

图2 得率与溶剂浓度的关系

(3)提取次数对得率的影响

称取2.5g药材粉末5份，以料液比1∶10，加入60%的乙醇，在45℃下超声提取，分别提取1次、2次、3次、4次、5次，每次45 min，抽滤后收集滤液，同上测定吸光度，得黄酮类化合物得率与提取次数的关系(如图3所示).

图3 得率与提取次数的关系

从图中数据分析可知，在提取试剂、超声温度、试剂浓度、提取时间以及料液比等条件相同的前提下，超声辅助处理不同的次数，所测定的提取液的吸光度值随着次数的增加而变大，但是当提取次数达2次以上时，随提取次数的增加，吸光度值变化不大，考虑到实验成本及便捷性，选择超声辅助提取2次为最佳.

(4)料液比对得率的影响

称取2.5g药材粉末5份，加入60%的乙醇，在45℃下分别以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30进行超声提取2次，抽滤后收集滤液，得黄酮类化合物得率与料液比的关系(见图4).

图4 得率与料液比的关系

从图4中数据分析可知，在提取试剂、超声温度、试剂浓度、提取次数、时间等条件相同的前提下，以不同的料液比进行超声辅助提取，所测定的提取液的吸光度有显著差异，而且当料液比为1∶20时，提取液中黄酮类化合物的含量最大.

2.2.2正交试验与结果

考虑溶剂浓度，提取时间，料液比，提取次数4个因素对提取贯叶连翘中黄酮类化合物的得率影响，设计四因素三水平L9(34)的正交试验，因素水平的设计见表1.

表1 因素水平表

称取质量为1.0 g的贯叶连翘干燥药材粉末，分别按照表2中试验号对应的提取条件进行超声辅助提取，所得提取液于可见分光光度计510 nm下测定吸光值，并带入回归方程中计算黄酮类化合物的含量，结果见表2.

表2 正交试验表

从表2的实验结果中可以看出，以贯叶连翘中总黄酮的含量为指标，影响得率的因素顺序为A>C>D>B ,最佳的提取工艺是A2B2C2D3，即贯叶连翘干燥药材粉末按照料液比1∶30，以体积分数为60%的乙醇超声辅助提取两次，每次45min，得到的黄酮类化合物含量最大，为70.028mg/g.

3 讨论

超声波辅助提取是利用超声波具有空化效应、机械效应以及热效应，这些作用增大了介质分子的运动速度，提高了介质的穿透能力，促进药物有效成分溶解及扩散，缩短提取时间，提高药物有效成分的提取率，鉴于超声波提取的特殊优点，若将其广泛引入到贯叶连翘的黄酮类化合物提取工艺中来，必将极大地促进其药效成分提取的工业进程.

黄酮苷元易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，黄酮苷易溶于水，难溶于有机溶剂，因此可用水或者不同浓度的有机溶剂来提取.用不同浓度的甲醇、乙醇提取时，甲醇提取效果略高于乙醇，考虑到实验的安全性，本研究选用乙醇的水溶液为提取溶剂.

本研究建立的比色法测定贯叶连翘中黄酮类化合物的含量，方法简便，快捷，可操作性强.超声提取省时实用，提取率较高.

[1] 国家中医药管理局《中华草本》编委会.中华草本精选本，上册[M] .上海：上海科学技术出版社，1998：681-682.

[2] 李建梅，孔令东. 中医药治疗抑郁、焦虑症的研究进展[J] .中国中药杂志，2001，26(12)：805-807．

[3]BarnesJ,AndersonLA,PhillipsonJD.StJohn′swort(Hyperi-cumperforatumL.):areviewofitschemistry,pharmacologyandclinicalproperties[J] .JPharmPharmacol,2001,53(5):583-583.

[4]CalapaiG,CrupiA,FirenzuoliF,etal.EffectsofHypericumperfo-ratumL.onlevelsof5-hydroxytryptamine,noradrenalineanddopamineinthecortex,diencephalonandbrainstemoftherat[J].JphamPharmacol,1999,51(6):723-723.

[5] 张 玖，张卫民，戴艳玲，等.贯叶连翘的研究和应用现状[J].中国野生植物资源，1998,17(4)：7-7.

[6] 丁明玉，赵纪萍，李擎阳.贯叶金丝桃提取物中总黄酮的测定方法[J].分析实验室,2001，20(6):45-47.